施毅教授

施毅教授谈到，新型冠状病毒是通过宏基因组高通量测序技术（metagenomic next‑generation sequencing，mNGS）在很短的时间内确认的。病原学诊断的理想指标应具有以下三个特点：①快，检测周期短；②准，敏感性和特异性高；③全，病原体种类与数量齐全。可以说，mNGS已经为形成这种理想指标提供了初步技术支持。

施毅教授指出，病原mNGS的优点在于不需要培养，不需要前提假设，从临床样品中提取核酸，利用基因组学的方法研究样品中所有微生物的种类和含量，而且能够基本达到对细菌、病毒、真菌和寄生虫等所有已知基因序列的病原微生物全覆盖。

在我国，虽然价格昂贵，但mNGS的临床应用非常广泛。 施毅教授将病原体的发现到诊断过程类比为从南京到上海的旅程：mNGS类似坐飞机，既快又准确；抗原抗体检测可比作高铁，收效一般；生物标志物检测可拟作开车，耗时耗力；图片镜检和培养则可比为坐船，在时间和经济上都是得不偿失。由于目前中国开展的常规实验室检查只有发达国家的三分之一，因此当临床医生碰到难以诊断的感染病例时，往往会考虑mNGS检查。这样一方面可能存在过度应用 mNGS技术的可能，但另一方面，施毅教授认为，这也导致我国mNGS应用积累了更为丰富的临床经验，能够进行总结和提高。

实际上，mNGS在临床应用增加后累积经验的同时，也给医生带来不少疑惑，例如，为何有些病例中明显存在感染征象却检测不出病原体，mNGS报告阴性是否代表一定不存在感染，检测出众多病原体导致治疗失去针对性等。施毅教授介绍，我国已经出台了相关指南为mNGS在感染病例中的应用时机和报告的正确解读提供了依据。

到底何时应该做mNGS检测？

施毅教授介绍，2020年11月，复旦大学附属华山医院张文宏教授作为通讯作者，在《中华传染病杂志》发表了《中国宏基因组学第二代测序技术检测感染病原体的临床应用专家共识》。作为针对所有感染性疾病的宏基因组学临床应用专家共识，该共识就mNGS技术的临床应用范围、分析解读和诊断效能等进行了证据总结，给出27条推荐意见，并首次针对不同感染症候群、不同病原体的适应范围给出了相应的推荐意见。

施毅教授指出，该共识明确了mNGS作为一线检测方法，主要应用于病重、病危、疑难、免疫缺陷、慢性中枢神经系统和新发罕见疾病中。2020年12月发表的《高通量宏基因组测序技术检测病原微生物的临床应用规范化专家共识》也认同这一点，推荐先进行常规实验室检查，无效才进行或同步进行二代测序检查。

表1 mNGS临床应用适应证说明

2021年2月，北京大学人民医院王辉教授作为通讯作者发表的《宏基因组高通量测序技术应用于感染性疾病病原检测中国专家共识》更为详细地对mNGS技术应用于感染性疾病的适应证从临床适应证、微生物学适应证、耐药学适应证及流行病学和感染控制学适应证四个方面进行阐述。

施毅教授介绍，《宏基因组高通量测序技术应用于感染性疾病病原检测中国专家共识》不仅具体介绍了mNGS技术“考虑”和“建议”应用的临床适应证，还明确了“不建议”应用的情况（图1）。施毅教授指出，临床微生物医师也要掌握微生物学适应证，当考虑出现疑似新发病原体、临床表现高度怀疑感染性疾病而多种传统技术反复检测不能明确致病微生物、传统病原学检测的结果不能解释临床表现、提示病原体可能具有高毒力表型等情况时，建议（或考虑）开展mNGS。

图1  mNGS技术的临床适应证

可见，mNGS可应用于感染病诊断的各个领域，在呼吸道感染、血流播散性感染、中枢感染、局灶感染和新发传染病等都占有一席之地。

如何正确解读mNGS报告？

推荐对病原体出现的频度和临床致病性进行分类并建立病原体分级标准

施毅教授指出，临床上另一个难点是如何正确解读mNGS报告，mNGS报告中仅简单汇总病原体和序列数的报告已经不能满足临床需求。在《中国宏基因组学第二代测序技术检测感染病原体的临床应用专家共识》中推荐对病原体出现的频度和临床致病性进行分类，分为高度致病性病原体、常见致病性病原体、低致病性病原体和无致病性病原体（图2 ）。

图2  推荐对病原体出现的频度和临床致病性进行分类

《宏基因组测序技术检测感染性病原体江苏专家共识（2020版）》指出，应该建立病原体分级标准。高等级的致病性病原体如结核分枝杆菌、新生隐球菌、鹦鹉热衣原体等在大部分类型样本中均可能是病原体；中等级的条件致病菌如念珠菌属在外周血、脑脊液、穿刺液等无菌体液样本中可能是病原体，但在痰液、肺泡灌洗液、尿液中可能是共生菌，需结合临床特征慎重判断致病可能性。低等级的条件致病菌如凝固酶阴性的葡萄球菌，在外周血、痰液、肺泡灌洗液、尿液等大部分样本类型中可能是共生菌，只在少数情况下如侵入操作后的脑脊液/外周血样本、感染性心内膜炎的赘生物样本中可能致病。疑似背景微生物引起的感染是指在某些感染样本类型中能与低等级的条件致病菌相互转化。因mNGS技术检测感染性病原体为定性检测，不能区分是否为优势菌，故对于某些开放性样品的诊断价值应持慎重态度。

mNGS报告微生物类型及汇报标准

施毅教授介绍，随着经验的积累，有些病原体的致病概率接近100%，如结核分枝杆菌、军团菌、恙虫病东方体、鹦鹉热衣原体等，这系列病原体一经检出，即可考虑是该病原体感染。有些病原体检出可能是感染，也可能是定植，要看免疫状态和基础疾病的情况，这类病原体包括铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯菌、金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌和曲霉等。有些病原体与人体共生、致病概率很低或鲜有病例报道，例如在呼吸道检出链球菌、皮肤表面检出丙酸杆菌、棒状杆菌、马拉色菌等，这类微生物致病概率接近于0。

但即便是严格致病微生物，在mNGS报告中一经检出则考虑是病原体，也存在一些例外的情况，例如，在呼吸道标本中疱疹病毒（HHV）检出阳性的比例增高。除了与卡波西肉瘤相关的HHV-8， 1型至7型HHV检出都可能和呼吸道感染有关。有学者提出在呼吸道标本中频繁检出HHV提示其可能是一种常见的病原体，但检出意义、临床表现和治疗价值等相关问题都需要进一步探讨。

mNGS报告结果判读

施毅教授认为，对于不同病原体在不同部位检出后，其mNGS序列数达到什么阈值才算阳性还缺乏具体标准，这也必将是未来的研究方向。只有探索出具体病原体在各部位（比如血液、胸水和肺泡灌洗液）检出的参考阈值，才有利于今后根据二代测序结果指导临床用药，而不是完全依赖临床表现调整治疗方案。

施毅教授表示，必须密切结合临床进行二代测序结果判读。在《中国宏基因组学第二代测序技术检测感染病原体的临床应用专家共识》中指出，当mNGS报告出现阳性结果时：①若患者mNGS结果阳性且符合其临床表现和其他实验室检查，则推荐依据mNGS结果指导临床决策；②若患者mNGS结果阳性且符合临床表现，但缺乏除mNGS结果外的其他实验室支持证据，应进行PCR验证（在具有合适引物的条件下），并建议临床进一步完善可获得的传统实验室检查加以验证；③若患者mNGS结果阳性，但临床表现或实验室检查结果不支持该结果，则不能仅依据mNGS结果进行诊断，而应以传统实验室检查结果为首要临床参考依据。当mNGS报告出现阴性结果时，可能存在以下几种情况：①真阴性，则排除感染；②假阴性，需要根据其他辅助检查结果（如培养结果等）高度提示感染可能，建议在此时应重复mNGS检测（表2）。

表2  mNGS假阴性原因分析

在mNGS报告中，一般序列数越高，病原微生物的可能性越大（数十条特异性序列），但存在一些特殊情况。《高通量宏基因组测序技术检测病原微生物的临床应用规范化专家共识》指出，病毒因极少存活于环境中，因此检出病毒少量的特异序列检出即可判为阳性（如少于3条特异序列）。而对于临床关注度高、且较难检测的病原菌如结核分枝杆菌、鼠疫耶尔森菌、布鲁菌，可采用独立的判读标准，即检出1条特异序列即可判为阳性。由于寄生虫基因组因较为复杂，且与人源基因组相似，应在严格确认序列特异性之后再行判读。而新发物种可不受阈值限制，但需给出同源性比对结果。

因此，临床医生应了解不同部位的常见病原体，在该部位检出不常见病原体时应考量其致病的可能性。掌握如呼吸、神经和血液等系统常见的细菌、真菌、支原体/衣原体、DNA病毒和RNA病毒，对正确评估mNGS报告大有裨益。当感染科医生具备丰厚的知识储备，也就不易被mNGS报告所误导。

mNGS改进的方向

提高mNGS检测准确性需要降低mNGS报告的假阴性率以排除感染，同时降低假阳性率以明确感染。施毅教授介绍，定量宏基因组检测(Q-mNGS)可通过人源指数（Host index）和病原指数（Q index）结果来建议是否对样本进行人源复测，以还原样本中病原微生物的相对含量，评估感染严重程度。除此之外，还有其他技术可以提高mNGS检测准确性，包括：①对脑脊液或血液等人源性标本先离心后同比压缩再进行检测；②对血液先反向富集病原体，破壁后应用病原PCR去靶向捕获正向富集病原体DNA，再行mNGS检测；③对血浆和血细胞做两次mNGS；④结合样本特点设计特殊检测流程；⑤三代测序技术的应用。

通过缩短前处理、文库定量、高通量测序和数据分析整个流程的时间，目前已经可以在7h内报告mNGS结果，这为抢救危重病人留出更多治疗时间。此外，全流程自动化的流程方案和三代纳米孔测序也为进一步提高mNGS报告的准确性并缩短时间。 施毅教授指出，今后，mNGS技术的应用领域将从致病原筛查扩大到耐药基因筛查，从而为临床治疗过程中精准用药提供依据。

总体而言，mNGS在感染性疾病中的价值主要体现在疑难、危重、特殊人群的感染病例中。目前mNGS的临床应用尚处于早期阶段，也未形成美国食品与药物管理局（FDA）或国家药品监督管理局（NMPA）批准的用于病原诊断的流程和方法，临床应用共识和指南还有待进一步完善，希望未来有更多高质量mNGS临床研究为该技术在临床的应用提供指导。  

（本文由中国医学论坛报  杨璐绫  整理，施毅教授审阅）