讲者：

广州医科大学附属第一医院  黎毅敏教授

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纵观人类发展史，感染性疾病始终是人类健康的重大威胁。2020年，世界卫生组织（WHO）发布《2019年全球卫生估计报告》指出，感染性疾病已成为全球主要死亡原因之一。同年，《柳叶刀》（Lancet）杂志发表《1990-2019 年 204 个国家和地区 369 种疾病和伤害的全球负担：2019 年全球疾病负担研究的系统分析》的结果显示，感染性疾病目前仍然是人类健康的重要威胁。

黎毅敏教授指出，病原学诊断是感染性疾病诊治的重要环节。目前已知可引起人类疾病的微生物已超1000种，且新型感染性病原微生物不断出现（或发现），导致感染性疾病的病原体呈现多样化、复杂化的特点，应引起我们的高度重视。

NGS技术

目前，感染性疾病病原学诊断率低，50%以上感染者的病原体尚不清楚，因此，提高感染性疾病的正确诊断率极为重要。传统临床上使用的病原学诊断方法包括培养法、镜检、基于抗原抗体的免疫学检测和基于聚合酶链式反应（PCR）靶向病原体的分子检测。随着检测技术的不断发展，宏基因组测序以其无偏移、全覆盖、高效率等优势，越来越多地应用于临床病原学诊断之中。

黎毅敏教授介绍，二代测序、三代测序等高通量测序平台统称为下一代测序平台（NGS）。其优势为高度平行（几千万到几百亿条序列）、起始量小、高灵敏度，通过超高量的平行测序，可获得大量的序列。宏基因组测序（mNGS）是一种基于下一代测序技术的无须培养、无偏好性的病原检测技术，通过对临床样本中直接提取的DNA和（或） RNA进行高通量测序，再通过数据库比对与生物信息学分析，可一次性完成细菌、真菌、病毒和寄生虫等多种病原体检测。与传统病原微生物检查方法相比，mNGS有巨大的优势。如培养法费时较长和需要使用不种培养基；镜检敏感性差，主要适用于细菌、真菌等；免疫法和PCR检测为低通量、靶向检测，需要预先假设病原体；宏基因组测序则为高通量、非靶向检测，无须预先假设。黎毅敏教授形象地介绍，传统微生物检测方法可检出的病原体有限，就像钓鱼，而宏基因组测序可检测出样本中的所有微生物，就像撒网捕鱼。

mNGS的临床路径包括临床评估，样本采集，样本处理，核酸提取、建库测序及数据分析，报告解读和临床决策。其中临床评估、样本采集和临床决策由临床医生完成，报告解读需要临床医生、数据分析人员及实验室人员共同完成，因此，临床医生在mNGS的临床应用中扮演重要角色。

NGS助力感染性疾病诊疗

随后，黎毅敏教授通过《新英格兰医学杂志》（N Engl J Med）于2014年发表的一个病例，介绍了NGS助力感染性疾病诊断，在临床应用的开端。患者男性，14岁，重度联合免疫缺陷综合征，持续4个月反复发热和头痛，在住院和门诊期间，6周之内进行了38项感染病原检测，未得出明确的诊断。患者先后联用5种抗生素但依然发热，并出现了神经系统症状（脑积水和癫痫持续状态）。医生使用mNGS技术对脑脊液进行二代测序，鉴定结果提示钩端螺旋体感染。最终美国疾病预防控制中心通过血清学检测和PCR技术证实为钩端螺旋体感染。治疗方案调整为青霉素治疗，32天后，男孩痊愈出院。该病例报道后，引起了全世界的关注。黎毅敏教授介绍，归纳来说，在重症感染患者中，NGS可以在提高病原体的检出率、检测罕见病原体、检测新发病原体、指导临床诊疗和改善患者结局等方面发挥重要作用。

NGS提高病原体检出率

2018年，《美国科学院院报》（PNAS）杂志发表一篇论文，研究者从致病菌、下呼吸道微生物和宿主表达基因三个核心层面出发，创新性地开发了一套mNGS数据分析系统，实现了定植菌和致病菌的有效区分与检测。结果显示，该mNGS数据分析系统用于检测92例下呼吸道感染和急性呼吸衰竭成人经气管抽吸液样本，检出率大大超过传统方法。

2019年，《新英格兰医学杂志》（N Engl J Med）发表的一项研究共纳入8家医院的204例儿童和成人患者，48.5%被收治重症监护室，所有患者30天死亡率为11.3%。在57例患者中检测出58种神经系统感染，其中通过NGS和常规检测均诊断出的有19例（33%），26例（45%）仅被常规检测诊断出，13例（22%）仅被宏基因组诊断出。该研究显示，脑脊液的宏基因组测序有助于脑膜炎和脑炎的病原体诊断，并在部分病例中对医生的治疗方案有指导作用。

2019年，《自然·微生物学》（Nat Microbiol）杂志发表的一项研究共纳入350例脓毒症患者，实验组采用mNGS测序，对照组采用血培养+组织培养/血清生化免疫/PCR检测。结果显示，血培养阳性的63例样本中，细胞游离DNA（cfDNA） mNGS阳性样本为59例，符合率为93.7%。以脓毒症综合参考标准评判，通过cfDNA mNGS检测到的阳性样本为169例，灵敏度为92.9%，对照组检测阳性样本132例，提示mNGS对脓毒症预警病因的识别能力更高。

抗菌药物使用后，细菌受到抑制，常规培养敏感性可能下降，而抗生素对mNGS的影响远小于传统细菌培养方法。2018年，复旦大学附属中山医院胡必杰教授在《临床感染病》（Clin Infect Dis）杂志发表研究论文，在接受抗菌药物治疗后，mNGS的敏感性（52.7%）显著高于传统培养方法的敏感性（34.2%），结论为，mNGS对病原体的识别具有较高的敏感性，且受抗生素暴露的影响较小。

mNGS 可检测罕见病原体

mNGS提高了对各种感染性疾病患者诊断的敏感性和特异性。2018年，Clin Infect Dis杂志曾报道一例通过mNGS测序快速检测脑炎患者中的波瓦桑病毒病例。2020年，《中华医学杂志》（Chin Med J）报道了一例利用NGS技术检测免疫功能正常的成人单纯疱疹病毒（HSV）相关脓毒症病例。患者男性，33岁，因发烧、上腹痛、呕吐和腹泻就诊。实验室检查肝脏和肾功能受损，疑似细菌感染性脓毒症。血培养、尿培养和病原血清学检测均为阴性，血液标本NGS检测14054 HSV-1 DNA reads。该病例为罕见原原体的非典型感染，对于这些患者的治疗，快速和特异的病原体识别比广覆盖抗生素使用更重要，可见，NGS是一种很有前途的通用脓毒症病原体检测方法。

mNGS可检测新发病原体

黎毅敏教授谈到，mNGS在检测新发病原体方面也具有明显优势。从2019年底我国武汉发现了不明原因肺炎病例，其基因序列在2020年1月5日即分析完成，正是mNGS在病毒鉴定中起到了关键的作用。相比2003年的非典型肺炎病原体SARS-Cov的鉴定却耗时5月余。此外，在新型冠状病毒肺炎疫苗开发中，从病毒序列被迅速鉴定、病毒结构表征完善和疫苗设计，NGS都起到了非常关键的作用。mNGS在传染病防控中也发挥重要作用。此外，mNGS可广泛用于病毒的溯源、进化分析，新发疫情的传染源鉴定，传播链的流行病学调研以及病毒变异株及流行的监控等。

NGS让脓毒症临床诊疗更精准

研究显示，脓毒症患者大约40%~50%不能明确病原微生物，初始治疗延迟，病死率显著高于明确病原微生物的患者，指南建议尽早并最好在1小时内开始抗菌诊疗，但46%的经验性抗生素治疗被证明是不恰当的。常规检测方法，例如细菌、真菌培养周期长（3-7 d），且培养阳性率低（8%~12%），而mNGS 技术可无偏性的检测细菌、真菌、病毒、寄生虫等病原体，具有检测速度快、准确率高、覆盖面广的特性，可以让脓毒症临床诊疗更精准。2019年，《重症医学》（Crit Care Med）杂志发表一项研究，比较了mNGS与血培养检测对外科ICU 48例脓毒症患者和17例术后无感染对照组患者的诊断价值。结果显示， mNGS阳性率比血培养显著提高（71% vs 11%），53%患者根据mNGS 结果调整抗生素治疗方案，对广谱抗生素的重新评估和可能的降级治疗提供帮助。此外，mNGS 还可以有效排除真阴性感染和辅助重症肺炎感染的早期诊断。

mNGS的三大应用场景

鉴于mNGS在感染性疾病诊断中的优势，该技术在危重感染、经验性抗感染无效、疑难感染或无法明确感染和（或）非感染性疾病以及疑似罕见、新发病原体感染方面有广泛应用。黎毅敏教授总结了mNGS三大应用场景。①“假设正确”，即传统微生物检测技术反复阴性且治疗效果不佳。②“假设困难”，即病情危重需要尽快明确病原体；特殊患者如免疫抑制宿主、合并基础疾病、反复住院的重症感染患者需要尽快明确病原体；长期发热和（或）伴有其他临床症状、病因不明的感染。③“难以假设”，即疑似新发病原体、临床上提示可能有一定的传染性；疑似特殊病原体感染。符合以上适应证的患者，应尽快送标本进行检测。

NGS的局限

与传统病原微生物检测相比，mNGS 敏感性高、信息量大，但也存在一定的局限性。① 真菌核酸的提取效率较低，一定程度上影响了最终的测序结果；② 目前仍缺少标准化的操作指南、测序结果和数据分析缺少临床解读标准；③ 缺少高质量、实时更新、全球共享的数据库；④ 存在时效、费用等问题。因此，未来NGS技术在设备、技术、质控规范及人员能力等方面都需要提高。此外，mNGS在临床中还存在阴性结果能否得出阴性诊断（排除感染）和阳性结果能否用于阳性诊断（明确感染）的问题。

目前，第三代测序纳米孔基因组测序已经在临床应用，期待未来NGS可以实现耐药基因、耐药突变和毒力基因的鉴定，NGS数据分析、数据库及报告标准化，mNGS检测设备、试剂及流程标准化，NGS数据分析算法的准确性和速度提升的同时，优化mNGS检测时长以及检测费用的大幅降低。

小结

黎毅敏教授总结，目前，感染性疾病的致病微生物鉴定困难，广泛的抗性素使用导致耐药菌快速增长。致病微生物的快速、准确鉴定对及早开展目标性治疗及优化治疗方案尤为重要。微生物传统诊断技术在敏感性、特异性、时效性、信息量等方面存在局限。mNGS具有快速、不依赖培养、全面、敏感等优势，已经成为感染性疾病的病原学诊断的一种新的有价值的诊断工具。但也应该注意，mNGS存在一定的局限性，必须与临床传统诊断手段结合才能达到锦上添花的效果。随着技术进步，未来mNGS将让更多的感染性疾病患者获得更好的临床受益。

（中国医学论坛报  佟艳华 整理，黎毅敏教授审阅）