HER2阳性或者ERBB2基因扩增约占乳腺癌的15%，包括单克隆抗体、小分子酪氨酸激酶抑制剂（TKI）、ADC药物等一系列抗HER2靶向治疗显著改善了HER2阳性乳腺癌患者的临床结局。但是既往抗HER2靶向治疗仅针对免疫组化（IHC）染色为3+或HER2/CEP17荧光原位杂交（FISH）扩增比率≥2.0且HER2拷贝数信号/细胞≥4的患者有效。因此，大多数乳腺癌患者（85%）被认为是HER2“阴性”（IHC 0或IHC 1+或IHC 2+/FISH-）。

基于在HER2 IHC评分为1+和2+（未扩增）的患者中观察到新型HER2靶向ADC药物的抗肿瘤活性，与治疗疗效紧密相关的HER2扩增概念正在逐渐发生变化。由于目前使用的HER2检测旨在区分HER2扩增和未扩增肿瘤，HER2 IHC在低表达范围（0和1+）的评分准确性较差。在一项80个美国病理学家学会成员水平测试的调研案例中，15例评定者间的一致性低于70%。这可能是由于在低表达范围内，通过HER2蛋白对肿瘤的染色非常弱。在一些研究中，HER2在肿瘤中的表达范围很广泛，从每个细胞表达约1000个分子至超过1,000,000个分子。极少数检测方法能覆盖HER2表达水平的3个数量级动态范围。例如，IHC染色法能覆盖的线性动态范围通常仅在一个数量级以内。因此，为了准确评估乳腺癌中HER2蛋白表达，需要使用不止一种抗体浓度进行多次检测，或者选择具有3个数量级动态范围的检测方法。

虽然对HER2表达进行全动态范围的检测可能具有价值，但现有的HER2检测方法仅可以区分HER2扩增和未扩增，只适用于曲妥珠单抗和其他靶向HER2扩增的药物。鉴于这些检测方式不包含HER2低表达范围，有必要构建一种分辨率在HER2低表达范围内的新型检测方法。这可能通过显色测定得到实现，该研究使用定量免疫荧光结合质谱标准化的HER2阵列形成一种可定量的检测方法，可在常规组织切片上测量以attomol/mm²为单位的HER2蛋白的绝对量，检测方法开发概述见图1。研究者旨在开发一种针对HER2低表达的特异性检测方法，并从系列回顾性乳腺癌病例集中检测HER2低表达的发生率。

图1. HER2低表达检测示意图。通过LC-MS/MS定量检测HER2表达范围的细胞系用于生成细胞微阵列（CMA）标准。测定细胞面积（mm²），可以将总蛋白中HER2表达的单位从amol/ug转化为amol/mm²。采用不同抗HER2抗体浓度对CMA进行染色，确定检测限（LOD）/定量限（LOQ）和线性度（LOL）。AQUA评分和amol/mm²之间的线性回归分析可以生成一条标准曲线，用于计算以amol/mm²为单位的HER2表达。使用AQUA分析乳腺癌染色组织。经过分析，HER2表达/病例可以amol/mm²为单位进行定量。

为了抗体验证，对靶向HER2胞内结构域的两种不同HER2抗体进行了检测；29D8（CST#2165；R-IgG），识别人HER2蛋白酪氨酸1248周围的残基，PATHWAY抗HER-2/neu（4B5）（Roche_#107918，R-IgG），识别人HER2蛋白的TAENPEYLGL表位（残基1242–1254）。首先，使用相同的工作浓度，在相同的染色条件比较YTMA263相同肿瘤位点中两个克隆的染色模式。用29D8和4B5测定的HER2水平高度相关（r_S=0.87，P<0.0001）（图3A）。由于4B5已被证明与ERBB4有交叉反应，在本研究中的分析仅使用29D8测定的HER2水平。此外，考虑到批间/操作员间的差异，在定义HER2低表达测定的优化条件后，由两名独立的操作员对标准化YTMA263和校准CMA进行染色，结果显示批间/操作员间具有高度一致性和重现性。（图3B, C）

图3. 抗体试剂的验证和质量控制。A HER2 ICD两个不同克隆之间的相关性散点图显示Operator 1和Operator 2在C的校准CMA和B的YTMA263的相关性，使用HER2低表达检测。

进行显色染色（Liquid DAB + Substrate Chromogen, Dako），然后用Tacha苏木精（Biocare Medical, Concord, CA, USA）复染3分钟，并用乙醇和二甲苯脱水。在耶鲁CLIA实验室，使用Leica Bond III Refine polymer DAB Detection和HER2/ErbB2 clone EP3 Epitomics 1:100，上以低pH提取40分钟（图2A）。Rimm Lab则使用1.28 μg/mL的HER2/ErbB2 29D8（克隆29D8，#2165，Cell Signaling Technology）和压力煮沸容器（PT Module, Lab Vision, Thermo Scientific, Waltham, MA）（图2B）。最后，使用Cytoseal 60（Thermo Scientific, Waltham, MA）封片，并在Aperio ScanScope XT平台中成像。

在x40下使用Aperio ScanScope XT平台对载玻片进行数字化扫描。使用QuPath评估每个细胞系的面积（mm²）/细胞，进行自动细胞分割可检测单个细胞核或细胞，并支持测算每个细胞所占面积。使用4个独立的CMA片子，每个片子具有两倍冗余。使用每个细胞系8次测量的平均细胞面积计算面积（mm²）/细胞。

TMA/CMA切片脱蜡后，在压力煮沸容器（PT Module, Lab Vision, Thermo Scientific, Waltham, MA）中用EDTA pH 8缓冲液在97 °C下进行抗原孵育20 min。然后将载玻片在0.3%过氧化氢甲醇溶液中孵育30 min，以抑制内源性过氧化物酶活性，然后与0.3%牛血清白蛋白和0.05%吐温-20封闭液再孵育30 min。将抗HER2的一抗（克隆29D8，Cell Signaling）用于组织，在4 ℃下以7种不同浓度/稀释度（0.000128 μg/mL~12.8 μg/mL）与细胞角蛋白（CK）以1:100稀释（单克隆小鼠抗人细胞角蛋白，克隆AE1/AE3；广谱筛选，Dako，Glostrup，Denmark）过夜孵育。使用的二抗包括anti-rabbit EnVision试剂（Dako）和anti-mouse Alexa Fluor 546（Invitrogen, 1:100），分别用于HER2和CK。Cy5酪胺（PerkinElmer, 1:50）用于显像HER2阳性细胞。使用4′,6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）复染和显示细胞核，用ProLong Gold Antifade试剂（Invitrogen）封片。

此外，使用HER2低表达测定方式，在同一天对来自两个独立YTMA489和YTMA499组织块（每个组织块含有一个非相邻肿瘤核心）的两个载玻片进行相同的染色程序，以观察批次差异。

使用PM-2000系统（Navigate Biopharma, Carlsbad, CA, USA）采集荧光图像，并使用QIF的AQUA^TM方法测定表达水平。如前所述，通过目标像素强度之和除以分子指定的隔室面积产生AQUA评分。为了区分肿瘤与组织基质和其他成分，通过将CK信号二值化并创建上皮隔室，创建了上皮肿瘤“掩模”。将AQUA评分标准化为采集图像的曝光时间和位深，以补偿任何变异性。对所有采集的TMA位点进行评估，分析时去除染色伪影或肿瘤（CK染色）小于2%的病例。

为生成标准化CMA，使用LC-MS/MS方法测定来自6种乳腺癌细胞系（BT-20、T-47D、ZR-75-1、BT-483、AU565、BT-474）和一种作为阴性对照的非乳腺癌细胞系（JURKAT）的细胞团块中的HER2表达。通过LC-MS/MS测定中连续一式三份稀释的BT-474（HER2高表达）和JURKAT（HER2无表达）的细胞混合实验，对LC-MS/MS试验的线性范围进行了探索。

通过LC-MS/MS测定以amol/ug为单位的总蛋白中7个细胞团块的DPPFCVAR（HER2蛋白的胞外域）和ELVSEFSR肽（HER2蛋白的胞内域）。以attomole/ug为单位的HER2定量范围从BT-20（最低未扩增细胞系）中的25 amol/ug至最高扩增细胞系（BT-474）中的1435 amol/ug。在JURKAT细胞中未检测到HER2。通过DPPFCVAR和ELVSEFR测定的HER2水平高度相关（Spearman系数r=1.00，P=0.004）。由于在乳腺癌细胞中观察到细胞膜表面的HER2胞外域被酶切，并且大多数常见的临床试验使用细胞质结构域抗体，因而在本研究中使用细胞内ELVSEFSR肽测量作为HER2的分析物。

在测定每个细胞系总蛋白中以amol/μg为单位的HER2浓度后使用相同的细胞系构建了CMA（Array Science, LLC）（图2，表1），因此可以将amol/ug转换为amol/mm²。为了建立优化的HER2低表达测定方式，重点关注该阵列的非扩增细胞系（JURKAT、BT-20、T-47D、ZR-75-1和BT-483）。为了将细胞中总蛋白的单位amol/μg转换为玻片上细胞占据的amol/面积，研究使用QuPath（开源软件）评价CMA上每个细胞系的面积（mm²）/细胞。使用4个不同后续载玻片中测量的平均值作为面积/细胞（mm²）的参考值。

表1. 细胞系阵列特征

如先前Gonzalez和Herrador所述，分析信号与分析物浓度之间的响应函数或校准曲线为单调函数。一些数学模型，如数学变换以及加权回归，可以检测响应度如何随分析物浓度的变化而变化。分析方法中常见的最简单模型是线性回归分析，根据公式（1）预测响应度。

Y=aX+β（公式1）

其中α为斜率，β为截距，标准差分别为s_α和s_β。

在本研究中，Y对应AQUA评分，X对应amol/mm²。

检测限（LOD）和定量限（LOQ）是从分析灵敏度相互推导出来的两个参数，用于评估性能特性。LOD是可以检测到并与系统噪声水平准确区分的分析物最低浓度，但不一定定量；测量值大于相关不确定值的浓度。LOD可表示为响应单位（YLOD），并使用公式进行计算：

Y_LOD =Y_blank +3 S_blank（公式2）

其中Y_blank和S_blank分别是通过测量至少10份独立样品空白获得的空白信号的平均值及其相应的标准偏差。在这种情况下，空白样本定义为染色过程中省略一抗的样本（见下文）。

LOQ是可定量测定的分析物最低浓度，具有可接受水平的精密度。通过测量至少10份独立样品空白并使用因子10而不是3进行计算，评价LOQ的公式与LOD的公式相似：

Y_LOD =Y_blank +10 S_blank（公式3）

为了评估Y_blank，使用标准化的HER2 YTMA263阵列，它有超过10例HER2低表达病例。当IF方案中不加入抗HER2一抗时，获得HER2低表达病例的AQUA评分（IHC为0、1 +、2 +/未扩增）后，评估Y_blank和S_blank，如上所述。

为了将以信号单位（YLOD、YLOQ）表示的LOD和LOQ转换为分析物浓度单位（ZLOD、ZLOQ），研究中使用了以下校准函数：

Z=（Y-β）/α （公式4）

使用范围在1.28 ng/mL到12.8 μg/mL之间的7个稀释度的一抗（HER2/ErbB2 29D8）对YTMA263进行染色和校准CMA。图4显示了标准化CMA的信号响应（标准化AQUA评分）和分析物浓度（amol/mm²）的线性回归分析。使用公式1-4能够鉴别各试验的LOD和LOQ。确定HER2低表达定量的最佳检测方法是29D8一抗的1.28 μg/mL，该浓度的抗体在未扩增细胞系（BT-483）中产生最高水平的信号，而噪声水平最低（来自Jurkat细胞的信号）。在1.28 μg/mL HER2 29D8抗体下，计算的LOD为0 amol/mm²，LOQ为2.8 amol/mm²。此外，为了评估试验线性限度，评价了每次试验的响应因子RF。响应的线性范围对应于从y=1.05α相交点至y = 0.95α相交点的分析物浓度，假设该模型呈线性且无截距。对于1.28 μg/mL含量测定，线性上限（LOL）为19 amol/mm²。

图4. 对照细胞系的回归显示了各检测抗体浓度下的重现性和相关性。以amol/mm²为单位的每种抗体（29D8）浓度作为X，AQUA评分为Y，进行线性回归。使用2-4倍冗余，使用线性回归方程测定各试验的LOD和LOQ。

在确定了最佳的线性HER2低表达检测方法后，研究者试图将其应用于一个大型队列，该队列包含2011-2014年间在YNHH采集的乳腺癌患者样本。使用364个肿瘤核心的TMA，在两倍冗余中，测量了HER2的表达水平。使用每例患者的两个空心针样本的平均值进行分析。根据最佳测定方式的回归分析方程（Y=296.4X+607.9，图4D）。图5显示了病理学家评分显色的所有病例的直方图（0=蓝色，1=红色，2=黑色，3=绿色）。Y轴显示了364个乳腺癌组织TMA空心针样本中的HER2水平（amol/mm²）。IHC 1 + 和2 + 病例的示例图像如图6A–D所示。使用该测定法，364例中有61例（17%）低于LOQ，58/264例（16%）高于LOL。大多数病例（67%）在试验的线性范围内。有趣的是，IHC 2+、1+和0的病例具有广泛的HER2表达动态范围，与之前的观察一致，即病理学家使用常规IHC检测对低表达范围病例进行准确评分具有挑战性或不可能。还应注意的是，定量测量是在组织微阵列点上进行的，而病理学家评分是来自整个组织切片。

图5. 连续收集的人群中乳腺癌病例的分布显示许多病例高于LOQ，而常规分析认为是阴性。364例乳腺癌患者中HER2低表达测定的直方图，以amol/mm²测量。颜色编码对应HER2 IHC评分；绿色（3+）、黑色（2+）、红色（1+）、蓝色（0）、灰色（NA，不适用）。LOQ定量限；LOL线性限；IHC免疫组织化学。A到D是图6中所示的情况。

图6.具有膜性表达模式的HER2低表达病例的图示。图5中病例的代表性图像显示IHC 1+（A）3.2 amol/mm²（B）、15 amol/mm²和IHC 2+（C）2.8 amol/mm²和（D）7.8 amol/mm²

一些病理学家使用术语“HER2正常”而不是“HER2阴性”来描述正常乳腺上皮细胞的HER2表达。为了研究无已知疾病的乳腺组织中HER2表达的动态范围，研究者对YTMA540的11个可用样本进行了HER2低表达检测，YTMA540是一个由2011-2014年乳房缩小成形术病例建立的队列。值得注意的是，这些病例均未超过10amol/mm²的阈值。尽管未来将使用该测定方式研究更多病例，但初步数据显示正常乳腺导管的HER2表达水平在2.5和10 amol/mm²范围内。未来观察哪些患者能从ADC药物治疗中获益以及其肿瘤HER2表达水平是否高于“正常”临界点（10 amol/mm²）十分有意义。

本研究使用定量免疫荧光和一系列表达HER2蛋白但ERBB2基因未扩增的细胞系，建立和验证了一种在组织样本中检测HER2表达的新方法。该方法基于质谱测量HER2蛋白量，并结合阵列形式进行标准化。HER2的表达在细胞系中以attomols/ug总蛋白测定，然后通过图像分析和面积测定转换为attomols/mm²，其中使用的AQUA分析方法可以评估单位面积的信号而不是单个细胞。这样形成的检测在2~20 attomols/mm²范围内是线性的，这个范围低于HER2扩增的细胞系或肿瘤的水平，但却在正常乳腺上皮细胞的HER2表达范围内。因此，研究者认为这个检测方法可在HER2靶向ADC药物有效的关键范围内检测HER2表达，而当前检测方法在这个范围内缺乏可重复性。

* 本文由阿斯利康提供支持，仅供医疗专业人士参考  

审批编号：CN-102687

有效期至：2023-9-19