慢病毒介导STAT3-shRNA对胃癌细胞化疗敏感性的影响及机制

本文作者：周伟 重庆市肿瘤医院

目的:探讨慢病毒介导的sh RNA靶向沉默信号传导及转录激活因子3（signal transducers and activators of transcription 3,STAT3）对人胃癌细胞SGC-7901化疗敏感性的影响及相关机制。方法:构建靶向STAT3基因的sh RNA序列,以慢病毒为载体转染SGC-7901细胞。以real-time PCR及Western blot检测STAT3干扰效果;MTT法分析各组细胞对5-氟尿嘧啶（5-fluorouracil,5-Fu）化疗敏感性的变化;用流式细胞仪比较细胞凋亡率的差异;Western blot检测抗凋亡蛋白B细胞白血病-2（B-cell lymphoma-2,Bcl-2）、髓样细胞白血病-1（myeloid cell leukemia-1,Mcl-1）及survivin的变化。结果:成功构建靶向STAT3基因的慢病毒并转染SGC-7901细胞,有效抑制55%STAT3 m RNA表达和40%STAT3蛋白表达（P<0.05）。STAT3-sh RNA转染后细胞的增殖抑制率及凋亡率均明显升高（P<0.05）,抗凋亡蛋白Bcl-2、Mcl-1及survivin蛋白水平明显下降（P<0.05）。结论:慢病毒介导的STAT3-sh RNA可抑制SGC-7901细胞增殖并诱导其凋亡,导致细胞对5-Fu的化疗敏感性增强,相关机制可能是通过抑制STAT3表达从而阻断STAT3信号通路,导致该通路下游的抗凋亡蛋白Bcl-2、Mcl-1、survivin的活性下调。

胃癌作为全世界最常见恶性肿瘤之一，其发病率及病死率皆在恶性肿瘤中居于前列，居消化道恶性肿瘤首位。外科手术是胃癌主要的治疗方式，但绝大部分胃癌患者在就诊时已发展为进展期胃癌，仅靠手术不能完全治愈，辅助化疗及新辅助化疗在临床上的广泛应用说明了化疗的重要性，尤其对于不能进行手术的晚期胃癌患者，化疗更是其首选的治疗方法。然而，由于癌细胞易对化疗耐受，以致化疗未能达到预期的疗效。临床上仅通过改变化疗药物组合的方式对癌细胞耐药的改善作用十分有限，随着分子生物学的快速发展，对胃癌分子特征的研究不断深入，能否在基因水平上逆转胃癌细胞的化疗抵抗性引起了科研工作者广泛关注。

信号传导及转录激活因子3（signal transducers and activators of transcription 3，STAT3），是细胞内一种信号传导蛋白，通过调控下游相关基因的表达，介导肿瘤细胞的增殖、凋亡、浸润及肿瘤血管生成等生理过程，与多种恶性肿瘤的发生发展密切相关，是潜在的抗肿瘤靶点[1-3]。研究者在胃癌细胞中也发现STAT3 的异常高表达，并且介导胃癌的发生发展^[2-3]。本实验拟构建STAT3-shRNA 慢病毒载体靶向干扰SGC-7901 细胞，观察其对5-氟尿嘧啶（5-fluorouracil，5 -Fu）的化疗敏感性的影响，初步探究相关分子机制。

材料

人胃腺癌细胞株SGC-7901 为重庆市肿瘤研究所提供；新鲜胎牛血清、RPMI1640 培养基、青霉素/链霉素溶液均购自美国Hyclone；兔抗人STAT3 单克隆抗体为Cell SignalingTechnology；B 细胞白血病－2（B-cell lymphoma-2，Bcl-2）、survivin、髓样细胞白血病－1（myeloid cell leukemia-1，Mcl-1）多克隆抗体均购自武汉博士德；鼠抗人β-actin 抗体、辣根酶标记的羊抗兔及羊抗鼠二抗为北京中杉；RT-PCR 试剂盒购自大连宝生物；PCR 引物由上海生工公司合成，Annexin V-PE细胞凋亡检测试剂盒购自上海碧云天；干扰载体载体pLKD.CMV.G&PR.U6.shRNA 购自上海纽恩。

方法

STAT3-shRNA 慢病毒表达载体的构建

选择GenBank 提供的STAT3 基因序（NM_139276.2）为靶基因，委托上海纽恩公司设计多个RNA 干扰靶点序列，结合设计软件评估测定结果及公司设计经验，最终确定并合成shRNA序列：5’-AACTTCAGACCCGTCAACAAA-3’，进一步合成双链DNA oligo，退火后与AgeⅠ和EcoRⅠ双酶切载体pLKD.CMV.G&PR.U6.shRNA 连接，转化细菌感受态细胞，对长出的克隆进行PCR 鉴定，测序比对正确后，抽提重组质粒，与包装质粒psPAX2、外膜质粒pMD2.G 共转染293T 细胞完成病毒组装。离心去除细胞碎片并用0.45 μm PES filter flask 过滤收集上清液，100 000×g，4 ℃超速离心2 h 后得到浓缩的STAT3-shRNA 病毒液。同法构建阴性对照病毒。进一步梯度感染293T 细胞，荧光显微镜下计算绿色荧光蛋白（green fluorescentprotein，GFP）数目，计算病毒滴度。测得干扰病毒滴度为： 3.80×108 Tu/ml，阴性对照病毒滴度为：6.51×108 Tu/ml。

细胞培养

用含10％小牛血清、1％的青/链霉素双抗的RPMI1640 培养基于37 ℃，5％CO2的培养箱中培养SGC-7901 细胞，每3 天按1∶3 的比例传代。

慢病毒转染SGC-7901细胞

实验共分为3组：实验组（STAT3-shRNA 转染组）、阴性对照组（空病毒载体转染组）、空白对照组（正常SGC-7901 细胞）。SGC-7901 细胞按1×106个/孔均匀接种至6 孔板，长至汇合度为30％～40％时，加入慢病毒（感染复数MOI=20），12 h 后更换为新鲜的无病毒培养基。

激光共聚焦显微镜观察绿色荧光蛋白

各组细胞按2×103 个/孔均匀接种至装有灭菌爬片的24 孔板中，48 h 后弃培养基，PBS 溶液洗3次，4%多聚甲醛固定10 min，轻轻取出爬片并倒扣于载玻片上，甘油封片后用激光共聚焦显微镜观察。

Real-time PCR 检测STAT3 基因表达

收集各组细胞1×106 个， trizol 法抽提总RNA，紫外分光光度计测RNA 纯度及浓度后逆转录cDNA，反应条件为：42 ℃ 60 min，95 ℃5 min，5 ℃ 5 min。取2 μl cDNA 模板进行PCR。STAT3 上游引物序列为：5’-GAGGACTGAGCATCGAGCA-3’，下游引物序列：5’-CATGTGATCTGACACCTGAA-3’，扩增产物长85 bp；内参引物β-actin 上游序列为：5’-CTGGAACGGTGAAGGTGACA-3’，下游引物序列：5’-AAGGGACTTCCTGTAACAATGCA-3’，扩增产物长140 bp。PCR 反应条件：95 ℃ 30 s，95 ℃5 s 及60 ℃ 30 s 共循环40 次。每个样本设3 个复孔，采用2-ΔΔCt 公式比较mRNA 相对表达水平，ΔCt =目的基因Ct 值-内参基因Ct 值。

Western blot 检测STAT3、Bcl-2、survivin 及Mcl-1 蛋白表达

收集各组细胞，裂解缓冲液（裂解液∶蛋白酶抑制剂混合物=500∶2）冰上裂解15～20 min，4 ℃、12 000 r/min 离心15 min 以分离细胞碎片。BCA 蛋白定量法测蛋白浓度，加入上样缓冲液煮沸至完全变性。50 μg 总蛋白提取物在10％SDS-PAGE 凝胶上分离，然后转至PVDF 膜（90 V，1.5 h）。室温下用含5％脱脂奶粉的TBST 溶液孵育1 h 以阻断非特异性结合，一抗（STAT3 稀释比例为1∶2 000，Bcl-2、survivin 及Mcl-1 稀释比例为1：200）4 ℃孵育过夜，TBST 洗膜3 次×5min；二抗（1∶2 500）37 ℃孵育2 h，TBST 洗膜3 次×5 min，最后用ECL 化学发光法显影。应用Quantity One 软件分析图像，蛋白相对表达强度用目的基因条带灰度值/β-actin 条带灰度值表示。

基于CT或PET/CT的影像组学信息预测Ⅰ期非小细胞肺癌立体定向消融放疗疗效的初步研究

本文作者：张军华 复旦大学附属肿瘤医院

背景与目的：影像组学作为极具潜力的新领域,是指从影像图像中提取有价值的图像特征,并将这些特征数据定量化并转换成可挖掘的数据用以指导临床。该回顾性研究应用影像组学的方法初步探索PET/CT对比常规CT在Ⅰ期非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer,NSCLC）患者接受立体定向消融放疗（stereotactic ablative radiotherapy,SABR）后疗效预测方面的可行性。方法:回顾性收集经病理证实并在复旦大学附属肿瘤医院行SABR治疗的Ⅰ期NSCLC患者,提取治疗前PET/CT和定位CT图像,由放疗科医师勾画病灶,运用影像组学的方法进行特征值的提取、分析和总结,采用NMF聚类法（non-negative matrix factorization）分析这些特征值是否能够对有无局部进展的患者进行区分,所有统计学算法都在R平台（R Development Core Team）上实现。结果:16例患者纳入最终分析,在PET/CT的影像组学PET特征中发现两个差异有统计学意义的特征值（灰度共生矩阵最大相关系数和灰度游程共生矩阵长行程加重）,可以用以区分患者是否出现局部进展,而在所有定位CT图像提取的特征值中并没有类似发现。结论:在经过SABR治疗后的Ⅰ期NSCLC患者中应用基线PET/CT及胸部定位CT提供的信息进行影像组学分析后,PET/CT似乎能够提供更具统计效能的PET特征值用以预测疗效,对比胸部定位CT提供的信息,PET/CT所提取的特征值可能更敏感、更全面甚至更具特征性。

医学影像学是现代医学的重要组成部分。一直以来，传统医学影像学所提供的信息都是非定量的，但近年来随着图像采集技术、标准化处理以及图像分析技术的进步，使得更多的影像信息能够被客观提取、精确定量并进一步通过各种算法转化为可深度挖掘的特征数据，经过深入分析这些影像特征数据，即可获得与疾病发生、发展及预后密切相关的各种隐含信息，并将其用于指导疾病治疗和预测疾病的转归。这一过程及由此新兴的领域，被形象地称为影像组学^［1］。

立体定向放射治疗(stereotactic body radiation therapy，SBRT)或立体定向消融放疗(stereotactic ablative radiotherapy，SABR)是通过1次至数次分割照射，将至少等同根治剂量的高剂量准确投照于颅外病灶的外照射方法^［2］。通过缩小照射区域、严格控制正常组织受量，同时提高放疗剂量［通常生物等效剂量(biologically effective dose，BED)大于等于100 Gy］，SABR在Ⅰ期非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)的治疗中获得了优于既往常规放射治疗的疗效。多项前瞻性研究显示，其在高龄、合并其他疾病及无法手术的患者中，SABR均能够有效应用，已经成为无法手术患者的标准治疗方案^［2-5］。随着SABR的广泛应用，相关的临床重点研究方向正逐渐由治疗实施转为疗效-损伤预测和复发判定。

影像组学中用以分析的图像数据可以通过各种影像方法获得，目前较多的是通过CT提取并分析，通过MRI和PET/CT进行分析的研究已在头颈部肿瘤、大肠癌的预测模型中取得初步成果^［6-7］，但在Ⅰ期NSCLC的SABR中该类研究国内外还未见发表。在这样的研究背景下，我们进行了一项回顾性分析，收集并整理本中心进行SABR的Ⅰ期NSCLC患者治疗前的PET/CT和CT影像，应用影像组学方法进行分析，结合患者疗效进行了初步的探索，目的是探讨PET/CT相关影像组学特征在预测Ⅰ期NSCLC患者SABR局控方面较传统CT是否能够提供更有价值的信息。

研究对象

本研究回顾性收集2008—2016年复旦大学附属肿瘤医院放疗科收治的Ⅰ期NSCLC患者。纳入标准包括：① 经病理证实的NSCLC患者；② 治疗前在本中心行全身PET/CT扫描，未提示局部晚期或其他部位转移的早期患者；③ 所有患者均在放射治疗中心针对肺部原发病灶行SABR治疗；④ 随访超过3个月。

PET/CT扫描及SUV计算方法

全身PET/CT检查的18F-FDG由复旦大学附属肿瘤医院核医学科Siemens RDS-ecliopse ST回旋加速器和explora FDG4模块生产获得，放化纯大于等于95%；显像仪器为Siemens Biography16HRPET/CT。患者空腹6 h以上，常规测血糖小于7 mmol/L，按7.4MBq/kg体质量静脉注射18F-FDG，静卧60 min后行PET/CT扫描。CT扫描层厚5 mm，范围为颅底至股骨上段(6~7个床位，每床位2 min)。PET图像经CT数据衰减校正后用有序子集最大期望值法进行图像重建，融合图像通过Wizard工作站MSV软件显示。依据ROI放射性计数与受试者体质量和注射剂量进行18F-FDG代谢率半定量计算。

图像勾画

由1名经验丰富的放疗科医师在PET图像及定位CT图像上完成大体肿瘤体积(gross tumor volume，GTV)及双肺的勾画，同时由另1名高年资放疗科医师进行核对。

影像特征提取及分析

本研究提取患者定位CT以及治疗前基线PET影像合计503个特征，其中定位CT中提取的影像特征253个，PET影像的特征250个，包括：① 形状特征，包括体积，表面积等特征(3个)；② CT像素值和PET SUV值的直方图特征(CT 19个，PET 19个)；③ 纹理特征包括GLCM灰度共生矩阵GLRL灰度游程特征(CT 31个，PET 31个)；④ 小波滤波后的一系列特征(CT 200个，PET 200个)。灰度特征计算算法采用在每层上计算，再取平均的方法［8］，所有计算均在MATLAB上(购自美国MathWorks公司)实现。

评价标准

患者的局部控制情况按照RECIST 1.1的标准进行定义：完全缓解(complete response，CR)定义为所有靶病灶均消失；部分缓解(partial response，PR)定义为所有靶病灶的直径之和下降至少30%；疾病进展(progressive disease，PD)定义为所有靶病灶的直径之和增加至少20%并且绝对值增加至少5 mm或者出现新的病灶；CR、PR和PD之外则定义为疾病稳定(stable disease，SD)。随访时间定义为自末次治疗开始到末次随访结束。总生存时间(overall survival，OS)定义为自治疗开始至患者死亡的时间。

统计学处理

影像组学特征结果与患者临床疗效之间的相关性采用t检验的方法进行，具体处理过程为首先采用相关性检验的方法去除影像组学特征之间的冗余^［9］，再根据患者的疗效进行分组，对不同组别的患者进行t检验，同时我们采用NMF聚类的方法分析影像组学特征是否能够对患者进行区分^［10］。所有统计学算法都在R(RDevelopment Core Team)平台上实现。P<0.05为差异有统计学意义。

奈达铂联合放射治疗对老年食管癌患者的疗效观察

本文作者：龙国贤 华中科技大学同济医学院附属同济医院

观察奈达铂联合放射治疗（放疗）对老年无法手术切除食管癌患者的疗效和安全性。方法：老年无法手术切除食管癌患者36例,随机分为治疗组和对照组各18例。治疗组每周给予奈达铂35 mg·（m²）-1,同时联合放疗,原发灶和区域淋巴结剂量为60 Gy,30次,共6周。对照组采用相同剂量单纯放疗。观察两组近期疗效和毒副反应。结果：治疗组和对照组客观缓解率分别为83.3%,61.1%（P<0.05）。治疗组白细胞下降、恶心呕吐和放射性食管炎发生率较对照组高（P<0.05）,但3或4级毒性少见。结论：奈达铂联合同步放疗治疗老年无法手术切除食管癌能显著改善近期疗效,毒副反应可耐受。 

食管癌是我国常见的恶性肿瘤之一，手术是其最主要的治疗手段。食管癌行单纯放射治疗( 放疗) 效果很不理想，其5 年总生存率不足30%，治疗失败的主要原因是局部未控制或复发，其次是区域淋巴结和远处转移^［1］。2008 年3 月～ 2012 年5 月，笔者采用奈达铂联合放疗对比单纯放疗治疗36例老年局部晚期食管癌，观察其疗效和安全性，报道如下。

临床资料

局部晚期食管癌患者36 例，采用随机数字表法将患者分入治疗组和对照组，两组均为18例。其中，男21 例，女15 例，年龄65 ～ 73 岁，中位年龄68 岁。病灶部位: 颈段4 例，胸上段11 例，胸中段17 例，胸下段4 例。所有患者均经病理证实为食管鳞癌，一般状态( performance status，PS) 评分≥2 分，手术前行超声内镜诊断为T3-4，且经胸外科会诊考虑无法手术切除，未行放、化疗，无穿孔前征象，无远处转移，骨髓、肝肾功能和心肺功能正常。

治疗方法

治疗组和对照组采用相同的放疗方案: 采用6 MV 或15 MV X 线，原发灶和区域淋巴结剂量为60 Gy，30 次，共6 周，至少92% 处方剂量的等剂量曲线覆盖全部计划靶区( planning target volume，PTV) 。危及器官限制剂量如下: 脊髓＜ 45 Gy，双肺接受不小于20 Gy 的肺体积占全肺体积的比例( V20) ≤30%且平均剂量≤15 Gy，心脏平均剂量＜ 40 Gy。治疗组自放疗开始接受每周奈达铂( 商品名: 捷佰舒，南京东捷药业有限公司生产，批准文号: 国药准字H20030884，规格: 10 mg) 35 mg·( m2 ) － 1加入0． 9%氯化钠注射液500 mL 中静脉滴注，共6 周，止吐采用托烷司琼注射液。

疗效判定标准

根据ＲECIST 标准，疗效分为完全缓解( complete response，CＲ) 、部分缓解( partial response，PＲ) 、病灶稳定( stable disease，SD) 和疾病进展( progressive disease，PD) ，客观缓解率( objective response rate，OＲＲ) = CＲ + PＲ。放疗结束后1 周内和3 个月均复查影像学检查，根据后者评价疗效，疗效达CＲ 或PＲ 的患者4 周后再次行影像学检查确认。按照CTC AE 3． 0 版评价奈达铂化疗毒性，按照美国肿瘤放射治疗协作组织( Ｒadiation Therapy Oncolygy Group，ＲTOG) 标准评价放疗毒性。

随访

所有患者均随访至2012年1月，失访2例，随访率为94．4%。

统计学方法

采用χ² 检验。P ＜ 0． 05 表示差异有统计学意义。

结果

近期疗效

两组所有患者均可进行疗效评估。治疗组中CＲ 4 例，PＲ 11 例，OＲＲ 为83． 3%。对照组中CＲ 2 例，PＲ9 例，OＲＲ 为61． 1%。治疗组OＲＲ明显优于对照组( P ＜ 0． 05) 。

毒副反应

治疗组骨髓功能抑制、恶心呕吐和放射性食管炎放射率较对照组高，其中白细胞下降和恶心呕吐差异有统计学意义，但总体3 级毒副发生率较低( 均未见4 级毒副反应) 。

讨论

目前，同步放化疗已成为局部晚期食管癌的标准治疗^［2］。顺铂是局部晚期食管癌联合化疗及同步放化疗中较有效和使用较广泛的药物。顺铂联合氟尿嘧啶方案有效率为50% ～ 60%^［3］。但是顺铂有明显毒性，包括恶心呕吐、骨髓抑制、肾毒性和神经毒性。因此临床上顺铂常常用于状态评分较好的患者。老年患者由于经常并发慢性疾病，对治疗耐受性较差，多数患者无法耐受顺铂的强烈化疗。奈达铂是第2 代铂类化合物，肾毒性较顺铂轻，骨髓抑制和血小板减少是其剂量限制性毒性，对多种肿瘤均有效^［4］。奈达铂单药治疗食管癌有效率约为30%^［5］。KATO 等^［6］研究显示放疗联合奈达铂+ 氟尿嘧啶方案同步化疗治疗不可切除的食管癌总缓解率为77%，1 年和2 年生存率分别为30．7%和10． 2%，中位生存期为10． 1 个月。徐瑞华等^［7］。报道，奈达铂联合氟尿嘧啶方案治疗初治食管癌有效率达29． 63%，其疗效优于顺铂联合氟尿嘧啶方案。国内多个研究显示，小剂量奈达铂每周联合放疗治疗老年中晚期食管癌有效率达89． 5% ～ 91． 3%，且奈达铂耐受性良好^［8-9］。

本研究结果显示，奈达铂联合放疗治疗老年无法手术切除食管癌有效率明显优于单纯放疗，结果与文献报道基本一致。同步放化疗组毒副反应较单纯放疗组发生率高，其中白细胞下降、恶心呕吐和放射性食管炎发生率明显高于单纯放疗组，但总体3 或4 级毒副反应少见。良好耐受性与奈达铂每周小剂量给药有关，在老年患者应用过程中安全性较好。

总之，奈达铂同步化疗联合放疗治疗老年无法手术切除食管癌近期疗效明显优于单纯放疗，而且毒副反应可耐受，但对远期生存的影响仍需长期随访和进一步研究。