肝细胞癌(HCC)是肝癌最常见和最致命的组织学类型，是世界范围内癌症相关死亡的第二大原因[1]。每年全世界HCC的发病率超过50万，并且逐年上升。慢性HBV/HCV感染、酒精性损伤、非酒精性脂肪性肝病、黄曲霉毒素、肥胖、糖尿病和肝硬化被认为是HCC的主要危险因素[2]。原位肝移植和手术切除是目前治疗肝癌最有效的方法，虽然索拉非尼和瑞戈非尼已被用于HCC的一线二线全身化疗，但对其耐药导致高病死率的担忧日益增加。大多数HCC患者被确诊时已为疾病晚期，错过了最好的治疗时机。另一方面，HCC易扩散转移、术后易复发，导致HCC患者术后5年的转移或复发率仍然很高，生存期较短[3]。因此，需要更多可靠的生物标志物用于HCC的诊断、治疗和监测。越来越多的研究发现环状RNA (circular RNA，circRNA)在HCC的发生发展中发挥着重要的调控作用。

1. circRNA概述

circRNA于1976年在类病毒颗粒上被首次发现[4]。其通过反式剪接使3’端和5’端以共价键相连接形成1个闭合环状结构。得益于其闭合的环状结构，circRNA对核酸外切酶不敏感。已知的circRNA的功能机制可以大致分为四类: (1)作为miRNA海绵；(2)调控转录过程；(3)与RNA结合蛋白(RNA-binding proteins，RBP)相互作用；(4)参与肽或蛋白质翻译。circRNA具有丰富性、动态性、保守性、稳定性，这些特性使circRNA在作为新型临床诊断相关生物标志物的开发应用上具有明显优势。新的证据表明，circRNA在HCC的发生和发展中发挥重要作用，并参与细胞增殖、肿瘤转移、免疫逃逸、代谢和耐药[5]。

2.circRNA在HCC发生发展中的作用

2.1   circRNA在信号转导方面对HCC发生发展的影响

HCC患者晚期表现之一是肿瘤细胞的侵袭和转移，有侵袭和转移的HCC患者预后不佳，circRNA表达失衡可能是HCC患者侵袭和转移发生的原因之一。在HCC中，circASAP1 (hsa_circ_0085616)通过调控miR-326/miR-532-5p/MAPK1轴增强HCC细胞的增殖和侵袭能力，此外，通过调节miR- 326/miR-532-5p-CSF-1通路介导肿瘤相关巨噬细胞浸润[6]。Lin等[7]发现circGprc5a可以通过海绵化miR- 1283激活Hippo信号通路关键下游蛋白YAP1/TEAD1，促进HCC的进展。circ_0061395通过调控miR-1182/SPOCK1通路，促进HCC细胞的发展，为HCC提供了一种新的靶向治疗方法[8]。Liu等[9]发现CircSTIL在HCC组织和细胞中表达上调。CircSTIL敲除通过调控miR-345-5p/AQP3通路减少细胞增殖、迁移和侵袭，抑制HCC进展。与此类似，circEIF3I在HCC中是一种致癌circRNA，下调circEIF3I可以通过circEIF3I/miR-526b-5p/HGF/c-Met通路延缓HCC肿瘤生长[10]。circ_0011232通过miR-503-5p/AKT3轴促进HCC进展，可能为HCC提供一种新的治疗策略[11]。circCBFB通过抑制miR-424-5p，使ATG14表达上调，从而促进HCC细胞增殖和自噬[12]。上述研究表明，致癌circRNA在HCC中通常上调，主要通过充当miRNA海绵促进肿瘤细胞的增殖、迁移和侵袭等进程。hsa_circ_0062682的上调促进了HCC细胞增殖、迁移和侵袭，其功能通过与YBX1及其他RBP相互作用实现[13]。SCD-circRNA2在HCC组织中表达上调，其中RBP RBM3以SCD-circRNA2依赖的方式促进HCC细胞增殖[14]。已有诸多研究表明，circRNA能够起到抑制HCC进展的作用。circPTTG1IP是HCC中的一种新型肿瘤抑制circRNA，低水平的circPTTG1IP通过miR-16-5p/RNF125/JAK1轴促进HCC的发展[15]。在HCC中，circRNA DOCK1和SMAD2表达升高，miR-654-5p表达降低，干扰circRNA DOCK1可通过调控miR-654-5p/SMAD2轴抑制HCC细胞的增殖、侵袭和迁移[16]。在体内外实验中，过表达circITCH可通过海绵化miR-184抑制细胞增殖、迁移、侵袭，促进细胞凋亡，而敲低circITCH则相反[17]。circFGGY通过调控miR-545-3p/Smad7轴抑制细胞生长、侵袭和肝细胞上皮-间充质转化[18]。在不充分射频消融后残留HCC中，circ-BANP通过与let-7f-5p结合，抑制HCC细胞的增殖、迁移和上皮-间叶细胞转化形成[19]。研究[20]表明，circDLC1可与RNA结合蛋白HuR结合，进而减少HuR与MMP1 mRNA的相互作用，从而抑制MMP1的表达，最终抑制HCC的进展。致癌circRHOT1还通过将TIP60(也称为KAT5)招募到NR2F6的启动子并增强其转录，从而抑制HCC的增殖和转移[21]。抑癌circRNA表达降低是肝癌的主要危险因素，对肿瘤细胞的增殖、侵袭和转移均有不利影响。表 1列举了部分在HCC中失调的circRNA的表达和功能。

表  1  circRNA在HCC中的生物学功能

2.2   circRNA在免疫方面对HCC发生发展的影响

在病毒感染过程中，circRNA表达谱发生变化，可调节免疫系统功能。例如，最近的一项研究[22]发现，HCC细胞通过外泌体分泌circUHRF1。临床生理表型显示circUHRF1表达高的患者中肿瘤体积较大，血液中NK细胞比例较低，微血管浸润较多。Kaplan-Meier生存分析显示，circUHRF1高表达患者伴随临床预后不良。circUHRF1可以通过上调NK细胞TIM-3的表达来抑制NK细胞分泌IFN-γ和TNF-α。该研究显示，肿瘤中血浆外泌体circUHRF1水平与NK细胞浸润水平呈负相关。研究者甚至提出了circUHRF1可能促进肝癌患者对程序性死亡受体1免疫治疗产生耐药的假设，但是证据仍然不足。来自HCC细胞的外泌体circGSE1通过调控miR324-5p/TGFBR1/Smad3轴诱导Treg扩增，从而促进HCC的进展[23]。据报道[24]，hsa_circ_0003410在HCC中明显上调，通过调节miR-139-3p/CCL5轴增加M2/M1巨噬细胞比率，促进HCC的进展。下调hsa_circ_0074854通过与HuR相互作用和抑制外泌体介导的巨噬细胞M2极化，从而在体内外抑制肝癌的迁移和侵袭[25]。上述研究证实了circRNA可以通过调节HCC患者的免疫系统来影响HCC的发展和预后，未来circRNA也许会成为理想的免疫治疗靶点。

2.3   circRNA在代谢方面对HCC发生发展的影响

近年来，circRNA与HCC代谢的相互作用引起了广泛关注。通过circRNA调控HCC细胞的代谢，可促进或抑制物质代谢的某些关键酶，从而改变HCC的增殖、侵袭、分化和转移等进展过程。因此，在一定程度上，一些参与代谢调控的circRNA可以作为HCC的潜在生物标志物。在缺氧条件下，circMAT2B通过海绵介导miR-338-3p上调PKM2的表达，增强糖酵解，从而促进HCC的进展[26]。在氧化应激条件下，circ-SPECC1通过miR-33a调控TGFβ2和自噬，促进HCC发生[27]。同样的，HCC细胞中circ_0091579部分通过miR-490-5p/CASC3轴促进细胞增殖、迁移、侵袭和糖酵解[28]。circRPN2通过加速烯醇化酶1 (ENO1)降解和调控miR-183-5p/FOXO1轴抑制HCC有氧糖酵解和转移，表明circRPN2可能是肝癌的治疗靶点[29]。在HCC中，下调circ-CFH通过调控miR-377-3p/RNF38轴，可抑制细胞增殖、迁移、侵袭和糖酵解，从而抑制HCC的发展[30]。hsa_circ_0001806在HCC组织和细胞中表达上调，过表达hsa_circ_0001806通过调控miR-125b/HK2轴促进肝癌细胞增殖、迁移和糖酵解，抑制细胞凋亡[31]。

3.circRNA与HCC耐药

目前，多激酶抑制剂、单克隆抗体和免疫检查点抑制剂是治疗晚期HCC的主要分子靶向治疗方法。然而，治疗结果却差强人意，主要问题是难以避免的耐药。越来越多的证据表明，circRNA在HCC耐药的发展中起关键作用。circ-001241在HCC组织和细胞中显著上调，通过调节miR-21-5p/TIMP3轴促进肝癌索拉非尼耐药[32]。circARNT2通过靶向miR-155-5p/PDK1轴抑制肝癌细胞对顺铂的敏感性[33]。hsa_circRNA_102049过表达可以通过海绵化hsa-miR-214-3p上调RELN基因的表达，增加HepG2细胞和Huh-7细胞对索拉非尼的敏感性[34]。Lu等[35]研究发现，在抗PD-1治疗反应不良和HCC术后预后不良的患者中circTMEM181表达升高。HCC细胞通过外泌体circTMEM181作用于巨噬细胞，从而增加其CD39的表达。这一过程与肿瘤细胞上的CD73协同激活eATP-腺苷通路，导致肿瘤环境中的腺苷升高，从而损害CD8+ T淋巴细胞功能，引起抗PD-1免疫治疗的耐药性。circUBE2D2的高表达与HCC患者的低生存率显著相关，体外实验[36]证明，circUBE2D2可通过miR-889-3p/LDHA轴加速HCC的糖酵解和索拉非尼的耐药，这为HCC治疗提供了一种新的方法。Weng等[37]研究通过RNA测序(RNA-seq) 在索拉非尼耐药的HCC组织中鉴定出了一种新型circRNA，circFOXM1。在功能上，circFOXM1显著抑制HCC的生长，调控索拉非尼耐药。circFOXM1下调可能通过释放更多的游离miR-1324和抑制MECP2的表达来调控索拉非尼耐药。circFBXO11在HCC组织中显著上调，通过海绵化miR-605，从而靶向FOXO3蛋白，FOXO3靶向ABCB1的启动子区，促进ABCB1的表达。总之，本研究揭示了circFBXO11/miR-605/FOXO3/ABCB1在HCC中介导奥沙利铂耐药的机制[38]。上述研究阐明了circRNA在介导HCC耐药中的作用，为晚期肝癌患者克服耐药提供了新的见解。必须进一步明确耐药的机制，并探索circRNA在分子靶向药物耐药中的作用。

4.HBV相关HCC

HBV是导致肝癌的主要因素。circRNA已被证实与HBV诱导的肝癌密切相关。有研究[39]从50 327个circRNA中，鉴别出1 187个circRNA在HBV相关HCC和HBV无症状携带者之间的表达存在显著差异。其中circRNA1002在HCC血清和组织中均显著下调，提示circRNA1002可以作为HBV相关HCC的生物标志物。在HCC组织和HBV转染的肝癌细胞中，circBACH1和MAP3K2表达升高，而miR-200a-3p表达降低。circBACH1缺失或miR-200a3p过表达可抑制HBV转染肝癌细胞中的HBV复制、增殖和转移[40]。circ_0027089作为一种致癌基因，通过竞争性靶向miR-136-5p调控NACC1的表达，促进HBV相关HCC的发生发展[41]。circ-RNF13可能通过调控miR-424-5p/ TGIF2轴抑制HBV相关HCC恶性进展和HBV感染[42]。HBV可以产生circRNA，但是其功能尚未明确。Zhu等[43]研究发现了一种由HBV产生的新型circRNA HBV_circ_1。生存分析显示，HBV_circ_1阳性患者的生存率明显低于HBV_circ_1阴性患者。并且，瞬时表达HBV_circ_1可以增强肝癌细胞增殖、迁移和侵袭能力，抑制细胞凋亡。此外，HBV_circ_1还与周期蛋白依赖性激酶1的相互作用，调节细胞增殖。血清外泌体hsa_circ_0028861在HCC中的表达低于慢性HBV和肝硬化，并且，hsa_circ_0028861联合AFP鉴别HCC与慢性HBV和肝硬化的ROC曲线下面积(AUC)为0.86，具有更好的诊断能力[44]。上述数据不仅为了解HBV相关HCC的发生机制和进展提供了新的线索，而且为治疗药物的开发提供了新的靶点。表 2概括了circRNA在免疫、代谢、耐药及HBV相关HCC中的生物学功能。

表  2  HCC中circRNA的表达及功能

5.   生物标志物

虽然HCC是原发性肝癌最常见的类型，但早期缺乏准确的生物标志物，导致HCC确诊往往较晚。随着分子生物标志物研究的进展和基因组学的发展，circRNA已作为一种新型的液体活检生物标志物被人们所认识。circRNA可在组织、外泌体、血浆、血清、唾液、尿液、脑脊液和乳汁等样本中检测到，其表达谱表现为细胞特异性或阶段特异性(表 3)。

表  3  circRNA作为HCC诊断和预后的生物标志物

Table  3.  circRNA as a biomarker for the diagnosis and prognosis of HCC

5.1   诊断标志物

研究[45]表明，hsa_circ_0001821在HCC的血浆中表达上调，AUC为0.692，提示血浆hsa_circ_0001821可能是一种新的HCC诊断标志物。其他研究[46]表明，hsa_circ_0064286和hsa_circ_ 0000475在HCC患者中均显著下调，与ALP、ALT、AST、AFP、胆红素水平呈负相关。circ_0064286的敏感度和特异度较高，分别为88.3%和96%，可能作为HCC诊断的潜在生物标志物。一项研究[47]对血清/血浆circ RNA或circRNA联合AFP检测在HCC诊断中的准确性进行了荟萃分析，结果显示，circRNA的敏感度为0.82(95%CI: 0.78~0.85)，特异度为0.82(95%CI: 0.78~0.86)。AFP的敏感度为0.65(95% CI: 0.61~0.68)，特异度为0.90(95%CI: 0.85~0.93)。circRNA的AUC为0.89(95%CI: 0.86~0.91)，AFP的AUC为0.77(95%CI: 0.74~0.81)。circRNA和AFP联合检测的敏感度为0.88(95%CI: 0.84~ 0.92)，特异度为0.86(95%CI: 0.80~0.91)，AUC为0.94 (95%CI: 0.91~0.96)。Zhang等[48]也证明hsa_circ_0006091 &AFP与hsa_circ_0006091&RGS12联合诊断具有重要意义，可作为HCC诊断的分子标志物。以上结果说明，血清/血浆circRNA是适合临床诊断HCC的生物标志物，circRNA与AFP的联合检测提高了HCC诊断的准确性，circRNA可作为监测HCC发生发展的生物标志物。然而，目前还没有一种方便可靠的血清circRNA生物标志物。

5.2   预后标志物

Chen等[49]发现，无论在HCC肿瘤组织还是血清中，肿瘤组circ_0000437表达显著上调，且与TNM分型、分化程度、肿瘤大小、BCLC分期相关(P＜0.05)。此外，较差的总生存期与circ_0000437的高表达相关，circ_0000437在血清中诊断HCC的AUC为0.928 1，上述结果提示circ_0000437可能作为HCC患者诊断和预后的一种新的生物标志物。最近一项研究[50]表明，circMED27在HCC血清中显著升高，与HCC患者不良临床特征和不良预后相关，并且促进肝癌细胞对乐伐替尼的耐药，提示circMED27可作为接受乐伐替尼治疗的HCC患者的潜在治疗靶点，并可能作为预测乐伐替尼耐药HCC的一种潜在的生物标志物。除此之外，hsa_circ_0005986的高表达与生存改善相关，是总体生存率和无进展生存率的独立预后因素[51]。此外，DHX9在HCC中表达显著上调，并抑制cSMARCA5的产生(hsa_circ_0001445)。DHX9是一种RNA解旋酶，可结合并抑制两侧反向互补序列的配对，从而阻止circRNA的产生。CSMARCA5通过SMARCA5/miR-17-3p/miR-181b-5p/TIMP3通路抑制HCC的生长。HCC组织中cSMARCA5的降低与肿瘤生长和转移的增加有关，使其成为肿瘤切除后患者的独立预后指标[52]。circRNA_101237在HCC患者的肿瘤组织和血清中表达上调，且与circRNA_101237的表达与肿瘤大小、淋巴结转移、远处转移及TNM分期有关。单因素和多因素分析显示，血清circRNA_101237水平是HCC患者生存预后的独立预测因素[53]。

6.小结

circRNA已经成为肿瘤分子生物学领域研究的新热点，目前circRNA在HCC发展、诊疗方面的研究尚处于初步阶段，仍存在许多问题。首先，通过RNA测序已在HCC中鉴定出了上千种circRNA，但只有少量circRNA功能被研究。如何从大量的候选circRNA中挑选发挥关键作用且具有临床价值的circRNA是一项巨大的工程。其次，目前对于circRNA的研究主要集中于肝癌组织，对于外周血、外泌体、尿液和唾液等分泌的circRNA研究较少。对circRNA进行多种类样本的全方位研究，有利于提高对circRNA复杂的调控网络的认知。重视体液中circRNA的研究，有利于开发用于肝癌筛查和预后监测的circRNA检测试剂盒。综上所述，筛选出发挥关键调控功能的circRNA，阐明其靶向分子和信号通路，将有助于发掘circRNA作为HCC治疗靶点的巨大临床价值。