研究背景

数百种病原微生物可引起下呼吸道感染（Lower respiratory tract infections，LRTI），因此，临床上很难及时、准确地确定其感染的病原微生物。目前传统的病原微生物检测方法，包括微生物培养、显微镜涂片等因缺乏快速、准确，使得该类方法在微生物学诊断中存在一定的局限性。

与传统方法相比，宏基因组二代测序（metagenomic next-generation sequ encing ，mNGS）技术是一种可检测临床样本中所有病原微生物的无差别方法。该方法具有效率高、耗时少，同时亦可追踪病原微生物的进化，并预测抗菌药物耐药性和毒力因子，推断病原微生物的载量。mNGS报告中有3个主要指标，包括测序读长(reads)、基因组覆盖度和微生物的相对丰度，目前对哪种指标最适合区分样本或实验室环境中存在的病原体、定植或污染微生物尚无统一标准，这也是阻碍其在临床应用的主要原因之一。本研究中，作者同时采用常规方法和mNGS检测了46例LRTI患者的下呼吸道标本，评估mNGS鉴定LRTI病原体的能力。

#01

通过常规微生物检测方法和mNGS鉴定细菌

根据综合评估，有20例患者被诊断为下呼吸道细菌性感染。常规方法显示：24份标本共鉴定出38株细菌，其中34株细菌为真阳性病原菌（图1A），4株 [包括大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、缺陷短波单胞菌（Brevundimonas diminuta）和放射型根瘤菌（Rhizobium radiobacter）各1株]被视为假阳性病原菌，占38株细菌的10.5%，检出细菌中最常见的是铜绿假单胞菌（7例），其次是鲍曼不动杆菌（6例）和嗜麦芽窄食单胞菌（6例）（图1B）。mNGS测序显示：28份标本共鉴定出63株细菌，其中29株（46%）为假阳性病原菌，检出细菌中最常见的是肺炎克雷伯菌（9例），其次是金黄色葡萄球菌（8例）、铜绿假单胞菌（8例）和鲍曼不动杆菌（7例）（图1C）。

图1 常规方法和mNGS检测LRTI病原菌的结果

#02

评估mNGS的3个主要指标——测序读长、基因组覆盖度和微生物的相对丰度在识别病原体方面的能力

以最终临床诊断为金标准，研究者使用ROC曲线来评估测序读长、基因组覆盖度和微生物的相对丰度在识别病原体方面的能力。为了排除不同病原体中测序深度和基因长度的影响，测序reads数被替换为每百万reads中来自于某基因每千碱基长度的reads数的对数[the logarithm of reads per kilobase per million mapped reads，lg(RPKM)]。结果显示：真阳性病原菌组的lg(RPKM)、基因组覆盖度和相对丰度显著高于假阳性病原菌组（P＜0.01）（表1）。ROC曲线显示，lg(RPKM)的曲线下面积（AUC）最大（0.99），其次是基因组覆盖度（0.98）和微生物相对丰度（0.83），相应的临界值分别为-1.35、12.92和0.25（图2）。真阳性病原菌3个主要指标之间的相关性分析显示（Spearman），lg(RPKM)与基因组覆盖度之间存在显著的正相关（r=0.951），而相对丰度与其他两个指标之间没有显著相关性（图3）。

表1  mNGS三个主要指标区分真/假阳性细菌的能力对比

图2 mNGS三个主要指标区分真、假阳性细菌的能力对比（ROC曲线）

图3三个主要指标间的相关性

#03

基于mNGS结果进行真阳性病毒分析

由于lg(RPKM)具有最佳的识别能力，且细菌和病毒的lg(RPKM)之间没有观察到统计学上的显著差异（图4A），研究者使用细菌lg(RPKM)临界值来识别感染性病毒。结果显示，mNGS共鉴定出61种病毒，根据lg(RPKM)临界值，其中35种被认为是真阳性病毒，其余被认为是假阳性病毒。最常见的真阳性病毒是人类γ疱疹病毒-4（10例），其次是人类α疱疹病毒-1（5例）。人类γ疱疹病毒-4和人类β疱疹病毒- 7占假阳性病毒的33%（图4B）。此外，人类γ疱疹病毒- 4最有可能与细菌共感染，10株人类γ疱疹病毒- 4中有6株（60%）与13株细菌共感染（图5）。

图4 基于mNGS的结果分析真阳性病毒

图5 热图展示的为细菌与病毒共感染的趋势

#04

mNGS在预测抗生素耐药中的表现

研究者还调查了mNGS检测的抗菌药物的耐药基因与抗生素敏感性试验（AST）结果之间的一致性。结果显示：（1）在4株鲍曼不动杆菌中检测到耐药基因blaOXA-23、blaOXA-51和blaTEM，而在1株鲍曼不动杆菌中仅检测到blaOXA-23和 blaOXA-51。药敏试验结果表明，5株鲍曼不动杆菌均对氨苄西林/舒巴坦（SAM）、哌拉西林-他唑巴坦（TZP）、头孢他啶（CAZ）、头孢吡肟（FEP）、头孢曲松（CRO）和亚胺培南（IPM）耐药（表2）。（2）6株肠杆菌科细菌中有4株中检测到编码A类β-内酰胺酶的耐药基因，包括blaCTX-M、blaSHV、blaTEM和blaKPC，抗生素耐药基因的存在与药物敏感性试验的结果一致（表3）。（3）在3株金黄色葡萄球菌中均检测到mecA耐药基因，药敏结果显示这些菌株对青霉素（PEN）和苯唑西林（OXA）具有耐药性（表4）。

表2 mNGS预测的鲍曼不动杆菌的耐药基因及与药敏试验结果的一致性

表3  mNGS预测的肠杆菌科细菌的耐药基因及与药敏试验结果的一致性

表4 mNGS预测的金黄色葡萄球菌的耐药基因及与药敏试验结果的一致性

编后：

本研究发现，mNGS通过直接对样本中的DNA或RNA进行测序，有效地克服了传统检测方法的不足。在mNGS的3个主要指标中，lg(RPKM)识别真阳性病原体的效力最高。此外，利用mNGS预测耐药基因为临床推断抗生素敏感性提供了一种新的策略。尽管在临床应用中仍需克服许多挑战，但mNGS将是临床微生物诊断的革命性技术。