200
评论
查看更多
密码过期或已经不安全，请修改密码
修改密码
壹生身份认证协议书
同意
拒绝
同意
拒绝
同意
不同意并跳过
作者：中南大学湘雅二医院呼吸与危重症医学科 罗红 王琳
呼吸道感染性疾病是临床常见疾病类型，主要分为上呼吸道感染和下呼吸道感染。累及鼻腔、咽/喉部的是上呼吸道感染，而累及喉以下的气管/支气管及肺部的是下呼吸道感染[1]。世界卫生组织（World Health Organization,WHO）发布的2019年全球前10位的死亡原因中，下呼吸道感染位于第四位，全年可导致260万人死亡；并且在低、中、中高和高收入国家中，下呼吸道感染是唯一一类位列前10位死亡原因的感染性疾病[2]。
感染性疾病有效治疗的重要前提是病原体的快速检测和准确诊断，仅采用传统微生物学及免疫学技术，有将近70%的患者将无法获得明确的病原学诊断[3]。因此，感染性疾病的诊断迫切需要快速、精准的病原体检测技术。目前高通量测序技术正在逐步应用于临床的实践[4]。
近年来,高通量测序技术在微生物检测中的开展应用,促进了不依赖培养的临床宏基因组学的发展,通过直接从自然状态下得到微生物组学的相关基因进行分类鉴定,将环境中全部微生物的遗传信息看作一个整体,摆脱了针对已知的单个或多个病原体进行意向性培养和分离的步骤,简化了检测流程,提高了病原检测的敏感度,缩短了检测时间,可对所有微生物进行分析,检出“未知”病原体及多种混合感染病原体,提供病原鉴定、分型、耐药基因和毒力因子分析,还可进行溯源分析,具有传统检测方法不可比拟的优势[3]。
高通量测序（NGS）技术包括宏基因组学二代测序(mNGS)和靶向二代测序(tNGS)等[5]。mNGS不依赖于传统的微生物培养，直接对临床样本中的核酸进行高通量测序，然后与数据库进行比对分析，根据比对到的序列信息来判断样本包含的病原微生物种类，能够快速、客观地检测临床样本中的较多病原微生物(包括病毒、细菌、真菌、寄生虫)[6-9]。tNGS是指在文库制备之前通过对样本中目标核酸序列富集扩增后再进行高通量测序的方法。其核心为依据已知病原靶向富集目标序列，减少不必要的测序资源浪费,降低时间和技术成本,提高检测灵敏度，可以快速鉴定预设的细菌、真菌、病毒、寄生虫等多种已知微生物,助力病原微生物的快速诊断，还可以检测多个预设耐药基因及毒力基因，助力病原微生物的快速诊断[10]。大量的研究指出mNGS在病原体检测方面具有良好的临床应用潜能,并且在临床应用规范方面形成了多部专家共识[11-15]。近几年,tNGS开始应用于临床,但尚未在临床实践中得到广泛应用中[16]。本文将聚焦于mNGS与tNGS的应用时机。
1
1.尽早使用 危急重症感染或下呼吸道感染不及时处理则后果严重,恐危及生命时,应在常规病原检测基础上,尽早使用mNGS检测辅助明确病原体;特殊病原体感染,存在群体性感染事件风险,应在开展常规快速检测的同时,尽早使用mNGS检测辅助明确病原体[13, 17]。
2.在治疗过程中使用 高度疑似感染性疾病但传统微生物检测反复阴性且治疗效果不佳时,考虑在完善常规病原学检测的同时或在其基础上开展mNGS检测;传统病原学检测的结果不能解释临床表现的全貌或/和抗感染治疗的反应,怀疑同时存在其他病原感染时,考虑在进一步完善更多病原学检测的同时或在其基础上开展mNGS检测;特殊患者如免疫抑制、器官移植术后、反复住院、合并基础疾病,疑似继发感染、新发感染时,考虑常规病原学检测的同时或在其基础上开展mNGS检测[18, 19]。
3.择期使用 表现为慢性或局部肺部感染,或慢性疾病不除外感染,在尝试常规病原学检查未能明确致病源或/和规范性经验抗感染治疗无效时，建议在进一步完善常规病原学检测的基础上，与患者充分沟通后择期使用mNGS检测辅助明确病原体[20]。
目前有关tNGS的临床研究有限，关于这个问题尚无一个定论，但可以明确的是，与常规检测相比，tNGS在重症社区获得性肺炎患者的肺泡灌洗液中[21]和急性下呼吸道感染患者的痰液中[22]对病原体诊断的敏感性和特异性均较高，如铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯菌和肠杆菌等；通过直接对痰液中结核分枝杆菌进行测序可提供比常规痰培养更全面的耐药检测结果[23]，可作为传统呼吸道样本检测的补充方法。tNGS可以同时检测多种细菌和病毒，传统的检测方法适用于特定的病原体，无法全面检测多种病原体，tNGS则能够在一次检测中获得更多的信息，有利于合并感染和复杂感染的检测，同时tNGS可以检测到极低数量或常规检测方法阳性率较低的病原体，如呼吸道病毒等。tNGS可从结核病患者的粪便中识别病原体及其耐药基因，为难以提供呼吸道样本的结核病患者提供关键的诊断信息[24]。
在中南大学湘雅二医院呼吸重症监护室，我们对于下呼吸道病原学未明确的肺炎患者，条件允许的前提下，会常规对患者行纤维支气管镜检查留取肺泡灌洗液送tNGS检测明确病原学，并根据病原学的结果制定抗感染治疗方案，密切关注患者的体温和咳嗽咳痰情况，3~5天动态复查炎症指标及肺部影像学，评估治疗效果，若疗效不佳，则再次行纤支镜检查留取肺泡灌洗液送tNGS检测，明确病原学有无改变，结合患者的体温和咳嗽咳痰等临床表现、实验室检查及tNGS的结果，动态调整抗感染方案。
首先，两者的共同点在于对于临床上常规方法难以诊断的患者，mNGS和tNGS有助于早期诊断和治疗，提高患者的预后[25]。
其次，两者的区别在于mNGS读码较短，高质量的序列读码有待改善，tNGS是一种对已知病原体的高灵敏度检测技术，显著提高低序列病原体的临床检出率[26]，弥补了mNGS的缺陷，提高病原微生物的检出率，进一步协助临床医生的诊治。
同时，tNGS可以通过引入内参，对病原体进行半定量，从而起到病情动态监测的作用。
对于疑难复杂感染或新发病原体感染的患者，推荐使用mNGS进行病原体检测，对于有明确病原体倾向性的患者，可使用tNGS进行辅助诊断。也有可能同时或者先后采用多种方法，如新发病原体采用mNGS获得初始序列后，再次评估时可选用PCR或tNGS进行检测[27]。
利用NGS技术进行病原体鉴定是一个新兴的领域，如何选择最佳的检测方法尚且有待进一步研究。我们需要大量的临床研究和实践来进一步探讨不同检测手段的适用范围和应用规范，临床医生需要结合患者病情及不同技术的特点来选择合适的检测方法。
呼吸内科副主任
呼吸危重症亚专科主任
主任医师，教授，博士研究生导师
中国医师协会呼吸医师分会危重症医学工作委员会副主任委员
湖南省医师协会呼吸医师分会会长
湖南省医学会呼吸康复委员会副主任委员
主持国家自然科学基金面上项目2项，主持中华医学会及湖南省科技厅科研项目5项，第一作者及通讯作者发表医学论文20余篇，主编论著3本，参编论著3本。2022年获得“全国五一劳动奖章”荣誉称号
[1] 邹晓辉,曹彬.呼吸道感染病原学诊断年度进展2021 [J]. 中华结核和呼吸杂志, 2022, 45(1): 78-82.
[2] ORGANIZATION. W H. Global Health Estimates: Lifeexpectancy and leading causes of death and disability [EB/OL].(2021-05-03) [M]. [2023-07-30].https://www.who.int/data/gho/data/themes/mortality-and-global-health-estimates
[3] 瞿介明,刘海霞.病原体分子诊断技术在下呼吸道感染诊断中的应用及其价值[J]. 中华结核和呼吸杂志, 2019, 42(7): 486-489.
[4] ZHANG T, NIU Z, WU F, et al. Qualitative and quantitative detection of surgical pathogenic microorganisms Escherichia coli and Staphylococcus aureus based on ddPCR system [J]. Sci Rep, 2021, 11(1): 8771.
[5] MITCHELL S L, SIMNER P J. Next-Generation Sequencing in Clinical Microbiology: Are We There Yet? [J]. Clin Lab Med, 2019, 39(3): 405-418.
[6] GOLDBERG B, SICHTIG H, GEYER C, et al. Making the Leap from Research Laboratory to Clinic: Challenges and Opportunities for Next-Generation Sequencing in Infectious Disease Diagnostics [J]. mBio, 2015, 6(6): e01888-15.
[7] WESTBLADE L F, VAN BELKUM A, GRUNDHOFF A, et al. Role of Clinicogenomics in Infectious Disease Diagnostics and Public Health Microbiology [J]. J Clin Microbiol, 2016, 54(7): 1686-1693.
[8] 张晖,弓孟春, 徐军, et al. 中国精准急诊医学的应用体系规划探索[J]. 中华急诊医学杂志, 2016, 25(10): 1219-1223.
[9] 周永召,李亚伦, 范红, et al. 临床宏基因组学在呼吸感染性疾病精准诊疗中的疑问解析[J]. 中国呼吸与危重监护杂志, 2018, 17(6): 539-543.
[10] SCHULTZHAUS Z, WANG Z, STENGER D. CRISPR-based enrichment strategies for targeted sequencing [J]. Biotechnol Adv, 2021, 46(107672.
[11] 《中华传染病杂志》编辑委员会.中国宏基因组学第二代测序技术检测感染病原体的临床应用专家共识[J]. 中华传染病杂志, 2020, 38(11): 681-9.
[12] MIAO Q, MA Y, WANG Q, et al. Microbiological Diagnostic Performance of Metagenomic Next-generation Sequencing When Applied to Clinical Practice [J]. Clin Infect Dis, 2018, 67(suppl_2): S231-s40.
[13] 宏基因组分析和诊断技术在急危重症感染应用专家共识组.宏基因组分析和诊断技术在急危重症感染应用的专家共识[J]. 中华急诊医学杂志, 2019, 28(2): 151-155.
[14] 宏基因组学测序技术在中重症感染中的临床应用共识专家组,中国研究型医院学会脓毒症与休克专业委员会,中国微生物学会微生物毒素专业委员会, et al. 宏基因组学测序技术在中重症感染中的临床应用专家共识（第一版）[J]. 中华危重病急救医学, 2020, 32(5): 531-536.
[15] 中华医学会检验医学分会.高通量宏基因组测序技术检测病原微生物的临床应用规范化专家共识[J]. 中华检验医学杂志, 2020, 43(12): 1181-1195.
[16] LI B, XU L, GUO Q, et al. GenSeizer: a Multiplex PCR-Based Targeted Gene Sequencing Platform for Rapid and Accurate Identification of Major Mycobacterium Species [J]. J Clin Microbiol, 2021, 59(2):
[17] 中华医学会检验医学分会临床微生物学组,中华医学会微生物学与免疫学分会临床微生物学组,中国医疗保健国际交流促进会临床微生物与感染分会.宏基因组高通量测序技术应用于感染性疾病病原检测中国专家共识[J]. 中华检验医学杂志, 2021, 44(2): 107-120.
[18] 中国医师协会器官移植医师分会,中华医学会器官移植学分会.中国实体器官移植手术部位感染管理专家共识(2022版) [J]. 器官移植, 2023, 14(1): 11-23,48.
[19] 中华医学会呼吸病学分会感染学组.中国成人医院获得性肺炎与呼吸机相关性肺炎诊断和治疗指南(2018年版) [J]. 中华结核和呼吸杂志, 2018, 41(4): 255-280.
[20] WANG Q, MIAO Q, PAN J, et al. The clinical value of metagenomic next-generation sequencing in the microbiological diagnosis of skin and soft tissue infections [J]. Int J Infect Dis, 2020, 100(414-20.
[21] LI F, WANG Y, ZHANG Y, et al. Etiology of Severe Pneumonia in Children in Alveolar Lavage Fluid Using a High-Throughput Gene Targeted Amplicon Sequencing Assay [J]. Front Pediatr, 2021, 9(659164.
[22] CHAO L, LI J, ZHANG Y, et al. Application of next generation sequencing-based rapid detection platform for microbiological diagnosis and drug resistance prediction in acute lower respiratory infection [J]. Ann Transl Med, 2020, 8(24): 1644.
[23] DOYLE R M, BURGESS C, WILLIAMS R, et al. Direct Whole-Genome Sequencing of Sputum Accurately Identifies Drug-Resistant Mycobacterium tuberculosis Faster than MGIT Culture Sequencing [J]. J Clin Microbiol, 2018, 56(8):
[24] SIBANDZE D B, KAY A, DREYER V, et al. Rapid molecular diagnostics of tuberculosis resistance by targeted stool sequencing [J]. Genome Med, 2022, 14(1): 52.
[25] YANG H H, HE X J, NIE J M, et al. Central nervous system aspergillosis misdiagnosed as Toxoplasma gondii encephalitis in a patient with AIDS: a case report [J]. AIDS Res Ther, 2022, 19(1): 40.
[26] GAO D, HU Y, JIANG X, et al. Applying the pathogen-targeted next-generation sequencing method to pathogen identification in cerebrospinal fluid [J]. Ann Transl Med, 2021, 9(22): 1675.
[27] 赵聪琳,刘凯, 周永召.靶向二代测序技术与宏基因组二代测序技术在病原微生物检测中的应用[J]. 中华预防医学杂志, 2024, 58(1): 114-121.
本文由中国医学论坛报社呼吸与危重症编委会编委
空军军医大学第一附属医院 宋立强 教授组稿
查看更多
中国医学论坛报
壹生
今日肿瘤
今日循环
今日糖尿病
今日口腔
全科周刊
脱贫地区农副产品网络销售平台
京公网安备 11010202008182号
| 互联网新闻信息服务许可证编号：10120190017