结核病作为一种由结核分枝杆菌引起的全球性传染病，其历史悠久，甚至可追溯至新石器时代。在抗生素问世之前，结核病属于无药可医的难治之症，只有三分之一的患者可以在确诊后存活五年以上。世界上不少知名人士都曾因结核病而饱受折磨，其中，约翰·哈佛、肖邦、鲁迅、费雯丽、林徽因等都是死于结核病。

根据世界卫生组织(WHO)新发布的报告显示，目前结核病仍是威胁人类健康的全球性卫生问题，是全球死亡人数最多的单一传染病。结核病已成为某些发展中国家和地区，特别是艾滋病高发地区人群的首要死因。据统计，全球超过20亿人感染结核分枝杆菌（Mtb），每年增加约900万新发感染病例和超过300万死亡病例。

通过快速诊断和药敏检测正确指导临床用药是控制结核病的重要环节，因此结核病的检查对于遏制疾病扩大趋势必不可少。

在大多数医疗资源有限的国家，痰涂片检查（包括抗酸染色和金胺O荧光染色）仍然是主要的诊断方法，其特点是快速，但是假阴性率高，同时其结果判读也主要基于检验人员的经验判读。病原体培养的方法（如罗氏培养和BD BACTEC960液体培养）可以提高特异度，但是培养周期较长（4~8周）。目前，分子诊断如GeneXpertMTB/RIF 或宏基因组学检测能有效提高灵敏度并缩短检测时间，但是对设备平台的要求高、费用昂贵。结核菌素皮肤试验（TST)无法判断活动性或者潜伏感染。

由于噬菌体具有高度严格的宿主特异性，其在结核病诊断中受到广泛关注。噬菌体生物扩增法(PhaB法）是一种新型表型检测技术，可以快速诊断结核病并检测结核菌的药物敏感性（图1）。PhaB法具有许多优点，如成本低，检测时间短、操作简单等，同时，由于噬菌体只感染活菌，还可以减少误报的发生。

图1 噬菌体生物扩增法(PhaB法）诊断结核病示意图 

关于噬菌体在分枝杆菌检测中的应用

早在1947年，Gardner G.和Weiser R.第一次从耻垢分枝杆菌中鉴定出分枝杆菌噬菌体，从此开始了分枝杆菌噬菌体的研究与应用。1998年，英国Biotec Laboratories Ltd.公司生产出一种结核杆菌快速诊断试剂盒（噬菌体法）(FAST Plaque TBTM)，可快速检测结核杆菌，并可同时进行药敏试验。

随后，荧光素酶报告噬菌体技术也开始用于分枝杆菌快速鉴定。1993年，美国Albert Finstein医学院的Jacobs和Bloom等人组成的科研小组构建了一种整合了荧光素酶基因(Fux)的噬菌体。他们通过将大肠杆菌质粒pYUB216插入分枝杆菌噬菌体TM4的非必需区构建了穿梭质粒。荧光素酶指示的分枝杆菌噬菌体与在含抗结核药物培养基中短暂培养的待检菌混合后，能感染活的耐药菌，使之表达荧光素酶基因。再加入荧光素底物，活菌产生荧光，而敏感菌无荧光产生。Jacobs等人用荧光素酶报告噬菌体（luciferase  reporter phage，LRP）phAE40检测临床单耐药和多耐药结核杆菌菌株的药物敏感性也取得预期的成果，该实验可以在微孔板上进行，易自动化，快速，适合大量标本的筛选。尤其值得注意的是，药物对发光分枝杆菌荧光生成的影响还可以反映出药物的作用方式。Banaiee等人将LRP与近几年发展较成熟的BACTEC 460药敏检测方法进行了比较，证实LRP的敏感度为94%，平均需要2~4天就可以得出结果，而BACTEC 460需要1~2周左右。此法对利福平、链霉素和乙胺丁醇耐药的结核分枝杆菌菌株的灵敏度为100%，特异度为100%，对异烟肼耐药的结核分枝杆菌灵敏度为85.5%，特异度为95.5%。O'Donnell等人将改良质粒插入噬菌体φ²GFP10，提高感染复数（MOI）的同时，使荧光信号提升了100倍。

Jain和他的同事们构建了一个新的双重报告荧光菌噬菌体Φ² DRM。荧光报告噬菌体Φ² DRM融合了红色荧光蛋白基因tdTomato后，可以鉴定并定量耐药结核分枝杆菌。Mulvey和Malagon等团队通过重组噬菌体phSGM2与目标细菌的孵育后，进行总RNA提取和RT-PCR定量检测，可以检测极少量的分枝杆菌并鉴定耐药表型。最新研究开始推进噬菌体构建生物传感器，通过整合生物识别元件（噬菌体）和生物材料（包括细胞受体、组织和细菌）作为检测探针，可高灵敏度检测出结核分枝杆菌。

当前，全球结核病耐药状况令人担忧。常用的抗结核一线药物逐渐失去治疗效力，而二线的药物也出现耐药严重。新型药物的研制又是一个漫长的过程。一个成功的新药，从最初的研发到获得批准，平均花费15年时间，20亿美元的资金投入，还伴随着超过95%的失败率。

结核分枝杆菌是细胞内寄生的细菌，其最主要的宿主是巨噬细胞。巨噬细胞是免疫系统的先锋，遇到异物会将其胞吞进体内，然后利用溶酶体里的各种酶处理掉异物。结核分枝杆菌进入体内后也会被巨噬细胞发现并被吞掉，但是进入细胞后它能利用各种方法避开与溶酶体接触，即使接触也能耐受一定的攻击，从而愉快地在其中繁殖。因此，这种胞内寄生菌的药物研发难度就更大。

分枝杆菌噬菌体能够裂解破坏分枝杆菌的特点，很容易使人们联想到其具有治疗结核病的潜在价值。噬菌体在治疗多种细菌感染方面具有优势，再加上抗生素的滥用和误用以及耐药菌的日益流行，噬菌体已被认为是最有可能替代抗生素的新疗法。噬菌体在结核病治疗中的研究，已经从选择合适的噬菌体发展到同时使用多种噬菌体治疗，甚至使用噬菌体衍生纯化的裂解酶蛋白。 

关于噬菌体治疗分枝杆菌的研究前期主要是通过动物实验治疗。结核分枝杆菌感染的豚鼠模型试验结果显示，分枝杆菌噬菌体 DS6A治疗组豚鼠肺、肝脏和脾脏的菌载量明显减少，肉芽肿形成减少，推测可能是分枝杆菌噬菌体 DS6A短暂转运至巨噬细胞内从而清除分枝杆菌，具体机制尚待验证。研究人员使用脂质体作为载体将噬菌体TM4转运到分枝杆菌感染的细胞中（图2），结果显示分枝杆菌噬菌体 TM4可以有效清除胞内分枝杆菌。因此，研究人员认为脂质体是使用噬菌体治疗细胞内 Mtb 感染的合适载体。

噬菌体治疗的著名案例中有一名患有先天性肺囊纤维化的15岁患者。她因患有持续性播散性感染NTM脓肿分枝杆菌而无法进行肺移植，最终通过基因工程技术构建噬菌体组合成功治疗感染，但其治疗周期长达121天。另外还有一个病例是对81岁感染脓肿分枝杆菌患者使用三个噬菌体组合进行为期一个月的治疗。尽管最终患者症状有所缓解，细菌载量下降，但是痰培养和涂片结果显示脓肿分枝杆菌依然存在，而且对噬菌体依然敏感，而且患者血清中可以检测到IgG中和抗体。

截至目前，非结核分枝杆菌已经超过有190种，而且对于抗结核药物存在天然耐药。因此对于部分快速生长型分枝杆菌，噬菌体治疗或许能够体现它的优势。

图2 脂质体递送噬菌体治疗结核病示意图

结核分枝杆菌毒性、传染力、繁殖力在细菌家族中都称不上优秀，但凭借着极强的忍耐力，同时借着HIV这一东风牢牢霸占三大世界性传染病的其中一席。新冠疫情之下，漏检误诊的结核病患者较往年更多，耐药基因的水平转移和不断变异使得耐药结核进一步扩散。总之，结核病的诊疗仍然困扰着人类。

噬菌体疗法在应用于分枝杆菌感染临床诊疗的赛道上才刚刚起步，任重而道远，需要更多的科研工作者和医疗界人士的共同努力。

参考文献

[1] Seaman T, Trollip A, Mole R, et al: The use of a novel phage-based technology as a practical tool for the diagnosis of tuberculosis in Africa. Afr J Biotechnol. 2:40–45. 2003. 

[2] Shield, C. G., Swift, B., McHugh, T. D., Dedrick, R. M., Hatfull, G. F., & Satta, G. (2021). Application of Bacteriophages for Mycobacterial Infections, from Diagnosis to Treatment. Microorganisms, 9(11), 2366.

[3] Jain P, Garing S, Verma D, et al. Nanoluciferase Reporter Mycobacteriophage for Sensitive and Rapid Detection of Mycobacterium tuberculosis Drug Susceptibility. J Bacteriol. 2020;202(22):e00411-20.

[4]Mulvey, M. C., Lemmon, M., Rotter, S., Lees, J., Einck, L., & Nacy, C. A. (2015). Optimization of a nucleic acid-based reporter system to detect Mycobacterium tuberculosis antibiotic sensitivity. Antimicrobial agents and chemotherapy, 59(1), 407–413.

[5] Azimi T, Mosadegh M, Nasiri MJ, Sabour S, Karimaei S, Nasser A. Phage therapy as a renewed therapeutic approach to mycobacterial infections: a comprehensive review. Infect Drug Resist. 2019;12:2943-2959. Published 2019 Sep 17. doi:10.2147/IDR.S218638

[6] LIU, Z., GUO, S., JI, M., SUN, K., LI, Z. et al. (2020). Progresses of mycobacteriophage-based Mycobacterium tuberculosis detection. BIOCELL, 44(4), 683–694.

作者：郭明权

本文转发自上海噬菌体与耐药研究所