近日，四川大学华西医院唐红教授团队在国际肝脏病学期刊Hepatology（影响因子14.079）上发表了题为“Exosomal IFITM2 transmitted to DCs inhibits IFNα pathway activation and blocks anti-HBV efficacy of exogenous IFNα.”的研究论文。论文第一作者为四川大学生物治疗国家重点实验室2015级博士研究生石瑛，并列第一作者为四川大学华西医院杜凌遥医师，通讯作者为唐红教授。四川大学为该论文的第一作者和通讯作者单位。

HBV是一种DNA病毒，感染的血液或体内分泌物是其主要的传播途径。持续的HBV感染会导致慢性乙型肝炎（chronic hepatitis B，CHB），并增加终末期肝病包括肝硬化和肝细胞癌（HCC）的风险，严重威胁人类健康并造成巨大的社会负担。全世界大约有2.4亿人为乙型肝炎病毒（HBV）感染者，其中我国属HBV感染高流行区，现有的慢性HBV感染者约9300万人，其中2000万例为慢性乙肝患者。

核苷（酸）类似物（NUC）和聚乙二醇化干扰素α（Pegylated-Interferonα, Peg-IFNα）是现在仅有的临床上使用的治疗CHB药物。目前获得批准并应用于临床的核苷(酸)类似物包括拉米夫定、阿德福韦酯、恩替卡韦和替比夫定。核苷（酸）类似物具有抗病毒作用强，服用方便等特点，但由于核苷(酸)类似物不能清除病毒，只能抑制其复制，因此要长期服用。服用过程中，病毒可能出现基因变异，导致耐药。干扰素( interferon, IFN) 具有抗病毒及免疫调节双重作用，上个世纪起便被用于慢性乙型肝炎临床治疗。相较于NUC, Peg-IFNα具有有限的治疗持续时间和实现功能性治愈的优点。然而，Peg-IFNα对CHB患者的治疗结果仍然不是够理想。既往研究报道表明，在进行48周Peg-IFNα治疗CHB的后24周，HBeAg阳性患者的持续病毒学应答率（HBV DNA <2000 IU / mL）仅为30％，而HBeAg阴性患者为43％。因此，改善基于IFN-α治疗的反应性仍然是CHB患者治疗中的急需解决的基本问题。

IFNα的抗病毒功效是通过复杂的免疫反应实现的。当宿主被病毒感染时，先天免疫是病原体的第一道防线。在宿主识别入侵的病毒抗原后，内源性IFNα通过激活MAPK依赖的TANK结合激酶1（TBK1）和干扰素调节因子3（IRF3）的磷酸化而被触发合成。内源性IFNα与IFNα受体（IFNAR）结合，激活下游途径，尤其是JAK-STAT途径。激活后，形成STAT的同二聚体或异二聚体并转移到细胞核中以与干扰素敏感的反应元件（ISRE）结合，启动干扰素刺激的基因（ISG）的转录。一些ISG编码抗病毒成分，如Mx1、PKR或OAS1能直接抑制病毒复制，而还有一些ISG编码蛋白质以发挥免疫调节功能，这些免疫调节性ISG催化各种免疫反应，例如病原体识别、免疫细胞活化和内源性IFN合成。有趣的是，一些ISG编码的蛋白质会对IFN系统产生负面影响，从而损害宿主免疫防御。这些基因的表达水平对干扰素抗病毒疗效有很大影响。当HBV感染人体后，在不同个体中不同程度地激活这些关键ISG，抑制了干扰素通路中的关键基因（IFN基因，IFN受体基因，IRF基因），此时外源性干扰素的使用无法正常激活下游因子的表达，从而表现出对干扰素治疗无应答。因此，鉴定那些关键的负调节因子并阐明其机制对于提高IFNα的抗HBV功效至关重要。

外泌体，直径在30-150nm之间，是由几乎所有类型的细胞产生的脂质双层天然纳米颗粒。外泌体通过携带和运输功能性蛋白质、脂质和核酸，介导细胞间通讯而起到细胞间信使的作用。据报道，许多编码ISG的蛋白质被包装到外泌体中并穿梭到相应的受体细胞，从而触发下游信号传导。外泌体介导的ISG在IFN信号传导途径的调节中起重要作用。

在本课题中，研究者从GEO公共数据库中检索与干扰素治疗CHB疗效相关研究，选择GSE5474下载其高通量微阵列芯片检测数据。通过分析对IFNα具有不同反应的CHB患者的基因表达谱，研究者发现先天免疫或免疫调节相关通路在对IFNα治疗有应答的CHB患者与无应答患者中存在差异，提示宿主的免疫状态与对IFNα的治疗应答相关。在利用PCR array 对此进行验证时，研究者发现对IFNα治疗有应答的CHB患者中IFNα不同亚型的表达水平均高于无应答患者。此外，IFITM2却在对IFNα治疗有应答的CHB患者中表达较低，提示IFITM2水平可能与内源性IFNα水平呈负相关。在用qPCR进行验证时，我们也发现在对IFNα治疗无应答的CHB患者中IFITM2 mRNA的基线水平较高，而IFNαmRNA水平较低。与之一致的是，在无应答患者血清中的IFITM2蛋白水平也高于有应答患者和健康人。IFITM2属于IFITM家族，具有保守的跨膜结构，是一种经典的ISG，据报道IFITM2抑制一些RNA病毒复制，同时促进一些DNA病毒的复制，这表明当宿主面对不同的病原体时，IFITM2可能发挥不同的作用。

考虑到HBV主要在肝脏组织中复制，我们提取了不同病毒载量的CHB患者和健康人的肝组织进行IFITM2蛋白水平检测。IFITM2在高病毒载量组（HBV DNA>10⁶IU/mL）中的表达水平显著高于低病毒载量组（HBV DNA<10⁶IU/mL）和健康组织，但IFITM2在低病毒载量组和健康组中无明显差异。为探讨IFITM2的作用，我们选择CRISPR-Cas9/HDR基因编辑系统对Huh7中的IFITM2进行敲除。当我们用HBV质粒分别转染进Huh7细胞和Huh7 IFITM2-/-细胞并用Western Blot检测，发现Huh7细胞在转染HBV质粒后IFITM2水平明显增多，而HBV无法引起Huh7 IFITM2-/-中IFITM2的增多。同时我们发现在用IFNα处理条件下，HBV的病毒核酸和病毒蛋白水平在Huh7 IFITM2-/-中均低于其在正常Huh7细胞中水平，当回补IFITM2过表达质粒后，HBV 复制水平又出现显著回升，以上现象说明IFITM2会影响IFNα的抗HBV作用。

当研究者在Huh7细胞，一种人源性肝癌细胞系，转染IFITM2过表达质粒时，TBK1和IRF3的磷酸化水平显著降低，并抑制了IFNα2的转录水平。已有文献报道MAPK通路在调节TBK1和IRF3磷酸化中发挥重要作用，为了探讨IFITM2抑制TBK1和IRF3的具体机制，研究者检测了过表达IFITM2的Huh细胞中的三个MAPK通路中的关键因子(ERK,p38和JNK)及其磷酸化水平。过表达IFITM2后显著抑制ERK和p38的磷酸化水平，但对JNK的磷酸化程度无影响。为进一步探讨其具体机制， U0126和SB203580被分别用于抑制ERK和p38的磷酸化。我们发现10μM U0126处理后，ERK磷酸化受到明显抑制，并引起下游TBK1和IRF3的磷酸化受到抑制。而10μM SB203580处理成功抑制p38的磷酸化，但对TBK1和IRF3的磷酸化无明显影响，提示IFITM2主要通过抑制ERK磷酸化，减少TBK1和IRF3磷酸化及内源性IFNα表达。

考虑到宿主体内的树突细胞（dendritic cells，DCs）是机体内源性IFNα的主要产生来源，我们进一步探讨在被HBV感染的肝细胞中产生的IFITM2能否被转运到DC以抑制其干扰素合成通路。首先THP1被用来诱导成成熟的DC，并与经过不同条件处理的Huh7细胞共培养。在与转染了IFITM2过表达质粒的Huh7细胞共培养的DC细胞中，ERK,TBK1和IRF3的磷酸化水平均受到明显抑制。当在DC-Huh7共培养体系中使用外源性Peg-IFNα时，DC中的干扰素合成通路因子（ERK,TBK1,IRF）和Huh7细胞中的干扰素通路下游因子（STAT1,STAT2, MX1,OAS1）活性水平均出现明显升高。而在Huh7细胞中转染了IFITM2过表达质粒后，共培养体系中DC和Huh7细胞中的上述因子的活性形式水平均受到明显抑制。与之一致的是，用CRISPR-Cas9基因编辑系统敲除Huh7中IFITM2并与DC共培养时，较之未敲除组，DC中的干扰素合成通路因子（ERK,TBK1,IRF）和Huh7细胞中的干扰素通路下游因子（STAT1,STAT2, MX1,OAS1）活性水平均出现明显升高。

考虑到IFITM家族成员保守的跨膜结构，以及IFITM1和IFITM3曾被报道可以被包装进外泌体中，我们研究了IFITM2是否通过外泌体进行细胞间转运。从Huh7的培养基上清中分泌得到的外泌体，通过电镜确认了外泌体的典型茶托样结构。同时将纯化的外泌体标记后与DC细胞共孵育后，在DC细胞内观察到了被标记的外泌体。

当在Huh7细胞中过表达IFITM2时， 其分泌的外泌体上携带的IFITM2含量也上升；用外泌体合成抑制剂GW4869处理细胞时，Huh7分泌的外泌体上IFITM2含量也随之降低。为进一步验证，我们用Huh7分泌的外泌体与DC共培养后，发现过表达IFITM2的Huh7细胞分泌的外泌体会抑制DC中的ERK,TBK1和IRF3磷酸化，而此条件的外泌体用20%SDS处理后再与DC共培养，对DC中ERK,TBK1和IRF3磷酸化的抑制作用消失了。

在对IFITM2如何被包装进外泌体的机制进行研究时，考虑到IFITM2的跨膜结构特性，我们对其跨膜区域的可能修饰途径和位点进行了预测。预测结果显示位于其跨膜区域中间的70，71位的半胱氨酸位点具有较高的发生棕榈酰化修饰的可能性。在用2-十六溴烷酸，一种棕榈酰化抑制剂，处理Huh7细胞后，我们观察到其分泌的外泌体上携带的IFITM2水平显著降低。用对这两个氨基酸分别进行单/双点突变后的质粒转染Huh7细胞，较之野生型质粒处理组，其外泌体也显示出降低的IFITM2水平。在Huh7 IFITM2-/- 和DC共培养体系中用IFITM2野生型质粒处理组中，DC中的p-ERK, p-TBK1, p-IRF和Huh7细胞中的p-STAT1, p-STAT2, MX1,OAS1水平均较低。而用IFITM2 70,71位点点突变质粒处理组中，上述因子水平均有升高，双位点点突变的升高水平显著高于单位点点突变组。棕榈酰化抑制剂和IFITM2蛋白的70/71位点上的突变均影响其被外泌体包装，证明棕榈酰化对于IFITM2被包装进外泌体至关重要。

外泌体介导IFITM2向树突状细胞的转运抑制了IFNα合成，导致外源性IFNα处理下的IFN途径出现了应答障碍。该研究结果解释了CHB患者对IFNα治疗的不良应答反应的发生机制，并为解决这一临床问题提供了新的思路。

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专家简介

唐红教授--博士生导师，国家杰出青年基金获得者，四川大学华西医院感染性疾病中心主任，生物治疗国家重点实验室感染性疾病研究室主任，中华医学会感染病学分会副主任委员，中国医师协会感染科医师分会副会长，中华医学会肝病学分会常务委员。先后承担国家杰出青年科学基金，“863”、“973” 、“十一五”、“十二五”、“传染病重大专项和自然科学基金课题”共20余项，发表论文及综述200余篇，其中SCI论文80余篇。曾先后获四川省科技进步一、二、三等奖各1项，中华医学三等奖1项。任Virology J, 中华肝脏病杂志等多种杂志的编委。

来源： 吴阶平医学基金会肝病医学部