呼吸系统感染性疾病是儿童最常见的感染性疾病，肺炎是5岁以下儿童病死的首位原因，严重威胁儿童生命健康。呼吸系统感染的病原种类繁多，且不同病原感染临床表现有相似之处，给临床诊疗带来了极大挑战。对严重的下呼吸道感染患者，临床医生早期通常会在病原未明的情况下经验性使用广谱抗菌药物治疗。广泛的经验性使用抗生素不仅增加了相关不良作用和医疗费用，更会增加细菌耐药风险。病原体的快速鉴定是儿童呼吸系统感染性疾病早期诊断和合理用药的基础，对指导临床诊疗十分重要。本文对病原体检测常用检测技术在呼吸系统感染性疾病中的应用进行论述，以指导儿童呼吸系统感染病原体检测技术的合理应用，提升儿童呼吸系统感染的病原诊断能力

口咽拭子和鼻咽拭子的胶体金法病毒抗原检测是病毒检测较为常用的手段，方法简便，无检测环境和人员的要求，约30 min即可出结果，且检测成本较低，特异度较高，推荐应用于门急诊呼吸道病毒感染的早期筛查，对临床决策指导合理用药意义较大。但由于取材来源和样本病毒量不稳定及检测技术本身的问题，敏感性低。

病毒核酸检测可在较短时间内获得检测结果，敏感度和特异度较高，并可鉴定病毒亚型及检测病毒相对载量。病毒核酸检测可用于不同呼吸道样本，包括鼻咽、口咽分泌物、痰液、支气管肺泡灌洗液、胸腔积液和活检肺组织等。实时荧光定量聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）是最常用的方法。多重PCR是在普通PCR技术上发展起来的，可同时检测多种病原体，对样本量的要求较低，检测时间短，可实现高通量、高灵敏度、高特异性检测，临床应用价值较高。一项涉及5510个样本的荟萃分析显示多重PCR 检测病毒灵敏度和特异性分别为94.0%和98.7%，与传统检测（例如快速抗原检测和病毒培养）相比，多重分子检测的准确性更高。环介导等温扩增技术是一种新型核酸扩增方法，比实时PCR检测特异度和灵敏度更高、成本更低，且对样本杂质的容忍度更高。然而，它的多引物设计会导致假阳性率增加，其对残留污染检出率较高也对实验室封闭反应系统提出了更高的要求， 尚不适用于实验室条件相对不足的基层医院。多重PCR 检测技术是目前临床最常用的可靠方法，可用于门急诊和住院患儿的早期快速病毒诊断，在高度怀疑病毒感染、病毒抗原快速检测阴性时也有重要作用。

机体感染病毒后首先出现特异性免疫球蛋白M（immunoglobulin M，IgM）升高，特异性IgM抗体检测可用于门诊、急诊或基层医院的病原体筛查。但机体产生IgM在感染后1周左右，早期阳性率低。另外，感染后IgM可持续3～6个月甚至更久，检测阳性需结合临床做出判断。血清IgG抗体检测需采集急性期及恢复期双份血清进行比较，且体液免疫缺陷的患者可呈假阴性，因此早期诊断价值有限。

病毒分离培养是诊断的金标准，特异度高，可进行病毒鉴定分型，但其实验要求高，操作复杂，检测时间较长，且敏感度差，不适合临床常规开展。

呼吸道标本培养协助诊断细菌感染仍是临床应用的主流方法，可取下呼吸道分泌物、胸腔穿刺液、肺活检组织等标本进行病原培养和分离，并对培养的细菌进一步进行药敏试验，从而指导临床治疗。对于社区获得性肺炎，早期痰液培养是目前临床最常用的方法。肺泡灌洗液培养是明确细菌性肺炎的重要依据，因有创性检查，推荐用于经验抗生素治疗无效的肺炎、重症肺炎、免疫功能低下等患儿。但细菌培养周期较长，且抗生素应用会使培养的敏感性降低，常需联合其他检测方法来明确诊断。涂片染色镜检亦是发现细菌感染的重要方法，它的优点是快速、直观、成本低，临床易于开展，推荐呼吸道标本培养前常规进行涂片染色镜检，对于早期发现感染病原菌有一定的指导意义。

某些细菌感染还可进行快速抗原检测。如尿肺炎链球菌抗原在发病1 d 内即可被检测到，且儿童尿标本简单易获取，对于呼吸道感染的儿童可通过测定尿抗原来实现肺炎链球菌的快速、早期诊断。但该方法的不足在于感染后尿抗原可持续存在，3个月后浓缩尿检测仍为阳性，最长可维持1年以上，需结合临床表现进行解读。

铜绿假单胞菌是下呼吸道感染常见致病菌，特别是医院获得性肺炎、呼吸机相关性肺炎以及支气管扩张、肺囊性纤维化等患者，多重耐药铜绿假单胞菌导致的下呼吸道感染与更高的病死率有关。以实时荧光定量PCR为基础的检测方法可直接检测耐药基因，也可通过检测不同药物浓度下目的基因扩增推断该抗菌药物浓度是否有效，还可通过逆转录PCR检测不同药物浓度下目的基因转录水平评估细菌的耐药性。qPCR检测速度快，但耐药表型可能涉及多种基因突变及表达，仅检测单一耐药基因可能无法准确预测耐药表型。目前，临床抗菌药物选择仍需结合体外药敏试验进行综合评估。

上呼吸道样本的PCR检测对百日咳感染的诊断有重要意义，具有快速、准确、敏感度高（＞ 90%）、特异性强（＞95%）等特点，特别适合婴幼儿及未接受免疫接种的儿童及咳嗽＜2周的患者。咽拭子细菌培养是百日咳的标准检查方法，特异度100%，但培养周期长且敏感性低，特别是对经过抗生素治疗或标本采集时间过晚的患儿，可作为分子检测方法的补充，可用于分子检测阳性及没有条件开展分子检测的实验室。

肺炎支原体（mycoplasma pneumoniae，MP）培养是诊断MP感染的金标准，特异度高，且可通过体外药敏试验判断是否为耐药菌，但需特定培养基，且程序复杂、耗时长，灵敏度较低，不能满足临床快速诊断的需求。

MP血清学酶联免疫吸附试验是应用较广泛的检测肺炎支原体感染的方法，但MP-IgM在感染后约1周检测到，无法早期诊断，在一定程度上会影响重症和/或难治性病例的早期干预。胶体金免疫层析试纸条检测法可定性检测MP-IgM，试验结果可在5～10 min内通过肉眼进行观察，该检测方法无需任何仪器设备，具有方便、快速、廉价等优点，但报告结果只显示阴性或阳性，不能报告滴度，适宜在一般基层医院和门急诊快速筛查开展应用。颗粒凝集法通过检测恢复期和急性期MP抗体滴度呈4倍及以上增高或减低时可以确诊肺炎支原体感染，难以用于急性感染的早期诊断。MP抗原检测特异度和灵敏度均较高，且无需专业仪器设备，操作简单快速，在早期和快速检测中具有潜在临床价值，但其具有高特异度和高假阴性的特点，更适用肺炎支原体感染的初筛。

MP分子检测技术主要为核酸扩增技术，包括DNA扩增和RNA扩增，具有周转时间快、污染可能性低、灵敏度高、特异度高、不受时间和免疫功能限制等优点，已被认为是诊断MP感染的金标准。通过PCR法还可直接检测呼吸道标本耐药基因突变，获得结果快，在临床得到广泛应用。基因点突变导致的靶点改变是MP对大环内酯类耐药的最重要原因，23SrRNA对结构域Ⅱ区和V区与抗生素直接结合的碱基点突变可导致抗生素与核糖体亲和力下降而引起耐药，可通过测定23SrRNA的2063、2064等位点突变判断耐药与否。但所检测的耐药状况与临床疗效并不完全一致，临床结局可能还与大环内酯类药物的免疫调节作用以及病程自限等因素有关。

李小玲，祁媛媛，张晓波^*（复旦大学附属儿科医院 呼吸科，上海 201102）

本文转发自中国临床医生杂志

下期介绍：关于结核病和真菌的病原学检测