杜斌教授

杜斌教授指出，重症感染的治疗关键在于选择正确的抗菌药物，而正确抗菌药物选择的前提是鉴定出致病微生物。在众多微生物的鉴定方法中，微生物的培养是临床诊疗中使用最频繁的技术手段之一。除此之外，涂片镜检、抗原抗体检测、核酸检测等等可在不同场景或不同病原微生物感染时发挥作用。杜斌教授认为，传统病原微生物检测方法存在的共同缺点就是仅具有针对性但缺乏通识性。例如，使用军团菌抗原检测试剂只能检测出是否存在军团菌，至于是否同时存在肺炎链球菌就无从判断。所以，如果确诊某种感染的致病微生物，需要同时对细菌、真菌和病毒等多种微生物进行鉴别诊断，仅仅依靠传统检测方法将使临床医生陷入困境。特别是当面临罕见或新发感染性疾病时，例如此次新冠肺炎的病原鉴定，任何一种传统微生物检测方法作用都十分有限。

二代测序（next-generation sequencing， NGS）就为上述问题提供了一揽子解决方案。杜斌教授介绍，有学者认为NGS的推荐应用场景包括：① 临床上高度怀疑感染但是尚未确诊；② 广泛筛查后均为阴性结果，可作为最后检测手段；③ 根据症状或旅居史可推测疑似病原体，但尚无现成检测手段；④ 种群或基因学特征可为临床提供有用信息等等。因此作为病原微生物的感染确诊或排除手段，NGS的应用条件非常广泛。

杜斌教授总结感染诊断中NGS的局限性在以下几个方面：① 缺乏标准作业程序（SOP）；② 缺乏一致的判定标准；③ 无法区别致病微生物、定植微生物和污染微生物；④ 耐药基因检测的临床意义有限；⑤ 对真菌等微生物检测敏感度低；⑥ 临床研究中的检测结果存在假阴性。

杜斌教授介绍，在NGS的检测中，阳性对照可包含多种DNA病毒、RNA病毒、革兰阴性细菌、革兰阳性细菌、酵母菌、霉菌和寄生虫等等，阴性对照也可以为设置为缓冲液或者蒸馏水等。不同厂家或研究者选择不同阳性对照和（或）阴性对照对检测结果及结果解读是否存在影响仍没有确切答案。

二代测序报告中通常可提供总序列数、微生物序列数、物种信息、测序覆盖度、测序深度及相对丰度等多种信息。杜斌教授认为，由于阴性对照中也可检测出微生物序列数，因此对于一般微生物而言NGS检测阳性并不完全等于检测出致病微生物。但杜斌教授发现，对于NGS结果的解读存在很多其他问题，例如既往文献中已经提出10种以上判定标准、病毒和非病毒判定标准的差异以及NGS判定标准与临床结果比较的缺乏。缺乏一致的判定标准也是NGS结果解读中面临的最大问题。

很多研究都已经证实，NGS对于细菌感染的鉴定具有高敏感性。北京协和医院隆云教授2016年发表在《医学研究档案》（Arch Med Res）的一篇研究结果显示，重症监护室（ICU）的患者血浆样本的NGS检测比细菌培养的敏感性更高，而且结果更为丰富。上海交通大学附属第一人民医院2019年发表在《传染学杂志》（J Infect）的研究结果同样证实在重症肺炎患者中，NGS比常规检测方法检出更多细菌。杜斌教授认为，这种细菌核酸检测的高敏感性并不完全意味着检出致病菌。首先在于核酸检测无法判定微生物的存活状态，其次还存在致病、定植和污染微生物的区分，因此NGS结果与确定致病微生物还存在一定距离。

当前，越来越多的NGS报告声称可以提供细菌耐药基因的结果，但是杜斌教授并不认为这能为感染治疗提供更多有用信息。他指出，在NGS的耐药基因检测开展之前，mecA基因是检测最频繁的耐药基因之一。因为该基因序列高度保守，且仅在葡萄球菌属中表达。携带mecA基因的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）或者耐甲氧西林表皮葡萄球菌（MRSE） 即对青霉素类药物耐药，所以只能选择万古霉素、利奈唑胺或其他敏感药物。但是如果NGS报告同时检出肺炎克雷伯菌和阴沟肠杆菌，这两种细菌都可能携带耐药基因CTM-X-12，此时NGS的耐药基因检测结果并不能帮助治疗药物的选择。

杜斌教授认为，当细菌携带两种或两种以上耐药基因时，NGS的耐药基因检测结果意义同样有限。例如，携带AmpC基因的铜绿假单胞菌对亚胺培南和美罗培南敏感，对头孢他啶耐药；携带MexAB基因的铜绿假单胞菌对亚胺培南、美罗培南和头孢他啶敏感；而同时携带AmpC基因和MexAB基因的铜绿假单胞菌则对亚胺培南和头孢他啶耐药，仅对美罗培南敏感。而同时携带AmpC基因、MexAB基因和OmpF基因的铜绿假单胞菌则根本没法通过简单叠加就能判断出耐药情况。杜斌教授强调，由于细菌耐药基因型和耐药表型之间的关联复杂，当前NGS耐药基因型的检测并不能够取代传统细菌培养联合药敏检测。

NGS在侵袭性真菌感染，尤其是霉菌感染中的检测结果存在问题。上海交通大学附属第一人民医院2019年发表在《传染学杂志》（J Infect）的研究结果中NGS检测真菌阳性率为6%，而传统真菌检测方法阳性率为14%。杜斌教授介绍其团队在近期研究中发现，侵袭性肺曲霉病中NGS检测敏感度为45.5%，而培养联合半乳甘露聚糖检测（GM试验）的敏感度达到97.8%。导致NGS在真菌检测敏感度低的可能原因为：① 少量曲霉菌即可致病；② 曲霉菌细胞壁较厚，标本处理提取核酸存在困难。

通常认为，NGS在免疫抑制的患者感染，检测生长缓慢的苛养致病微生物，提供致病微生物的额外信息，检测新发致病微生物和感染临床表现不典型时应用具有较高价值。

杜斌教授介绍，法国学者2017年在《临床微生物感染》（Clin Microbiol Infect）杂志发表了一项研究，其结果表明在免疫低下人群中非靶向NGS检测比传统微生物学方法检出更多病毒和细菌。而且该研究中NGS的阴性预测值为0.98，即当NGS未检出任何病原微生物就可以确认该病人不存在感染。但是《新英格兰医学杂志》（N Engl J Med）2019年发表的一项研究并不支持上述观点。研究人员在确诊感染性脑炎或脑膜炎的患者中使用宏基因组NGS（mNGS）测序检出致病微生物32例，26例通过传统检测方法检出病原体但mNGS未检出（图1）。作者提出mNGS假阴性率高存在的可能原因是病例确诊是通过血清标本，而mNGS检测标本来自脑脊液而非脑组织以及致病微生物在脑脊液中滴度低。但杜斌教授认为，NGS检测假阴性率高的问题需要进一步深入了解。

图1. 在脑炎或者脑膜炎患者中，mNGS检出致病微生物的例数（图片源自文章Clinical Metagenomic Sequencing for Diagnosis of Meningitis and Encephalitis）

在杜斌教授看来，NGS除了上述客观局限性而产生的疾病诊断问题，还有一个潜在问题是导致临床医生过度依赖。由于NGS检测微生物核酸不存在偏倚，所以在检测一些无法通过常规培养的微生物时具有得天独厚的优势。但广泛应用NGS，可能会使临床医生放弃掌握不同感染性疾病的临床表现和影像学表现等相关临床诊疗经验和技能的培养和积累。

杜斌教授总结道，成功的抗感染治疗需要应用正确抗菌药物，因此鉴定或者鉴别致病微生物非常重要。NGS作为鉴定病原微生物的新手段，相较于传统病原学检测方法而言具有更高敏感性。但到目前为止，在感染性疾病的诊断中，NGS应用还存在很多不容忽视的问题亟待解决。

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