研究背景

中性粒细胞胞外陷阱（NETs）是中性粒细胞经 NETosis 释放的 DNA-组蛋白复合物，在宿主防御时可捕获病原体，但过度形成会加重组织炎症与损伤。

传统观点认为NETosis依赖NADPH氧化酶2（NOX2）产生的活性氧（ROS）触发，这一机制由Brinkmann等首次阐明。

慢性肉芽肿病（CGD）是一种因NOX2复合物基因突变导致ROS缺陷的遗传病，其特征为反复细菌和真菌感染及肉芽肿形成。然而，在NOX2缺陷的CGD小鼠模型中，研究者发现NETosis可以被线粒体产生的活性氧（mtROS）激活，且这一过程依赖于钙诱导的SK3（小型钾通道）和Akt的激活，而非NOX2，这表明存在一种NOX2非依赖性NETosis途径。然而目前NOX2非依赖性NETosis途径的诱因和病理意义尚不明确。

多种肾脏疾病（包括急性肾损伤、小血管血管炎、系统性红斑狼疮、血栓性微血管病和慢性肾脏病）与NETs有关。本研究聚焦于两种NETosis途径在炎症性急性肾损伤（AKI）中的作用差异，阐明NOX2非依赖性NETosis对缺血再灌注损伤（I/R）后炎症性急性肾损伤（AKI）的影响。

肾缺血再灌注损伤是AKI的常见病因，涉及复杂的免疫炎症反应。在I/R早期，中性粒细胞浸润并释放NETs，但NOX2依赖性NETosis在肾损伤中是起保护作用还是加重损伤尚存争议。特别是CGD患者存在NETosis缺陷却仍发生肾损伤，提示NOX2非依赖性途径可能在特定病理条件下被激活并导致组织损伤。

研究团队通过对比野生型（WT）和gp91phox缺陷型X连锁CGD（X-CGD）小鼠的I/R模型，首次揭示了NOX2非依赖性NETosis通过富集氧化线粒体DNA（ox-mtDNA）激活cGAS/STING通路，从而加剧肾脏炎症的新机制。

研究方法与模型设计

研究采用严谨的对照设计，将WT（C57BL/6小鼠）与X-CGD小鼠进行对比。所有实验动物均为6周龄雄性，将其分为三组：WT I/R组（n=5-15）、X-CGD I/R组（n=8-15）和假手术正常对照组（n=3）。AKI模型通过单侧I/R 24min建立，再灌注后分别于8h（急性炎症期）和24h（损伤修复或进展关键窗口）处死动物收集标本。

为明确cGAS/STING通路的作用，研究设置了药理干预组：X-CGD小鼠在I/R前4小时腹腔注射cGAS/STING抑制剂C-176（750 nM/只）或对照溶剂。C-176是一种特异性STING抑制剂，可阻断STING蛋白的棕榈酰化，抑制其下游信号转导。

从WT小鼠和X-CGD小鼠的骨髓中分离出中性粒细胞。这些分离的中性粒细胞随后接受不同刺激物的作用，包括PMA（佛波酯）、TLR配体（如酵母多糖、脂多糖LPS和R848）以及含有核糖核蛋白（RNP）的成分（如小核RNP抗原sn-RNP-Ag和sn-RNP抗原-抗sn-RNP抗体免疫复合物RNP-IC），以诱导NETosis的发生。

研究结果

在I/R后8h，WT与X-CGD小鼠均表现出相似的急性肾损伤程度：肾小管间质结构破坏、炎性细胞浸润及肾损伤标志物Kim-1 mRNA显著升高。

免疫荧光分析显示，此时两组小鼠肾脏内NETosis（Ly6G⁺CitH3⁺细胞）累积量无统计学差异。然而，流式细胞术发现X-CGD小鼠损伤肾脏中7-AAD⁺死亡中性粒细胞比例显著高于WT，提示NOX2缺陷背景下中性粒细胞更易发生坏死性死亡。

至I/R后24h，WT小鼠损伤开始自发修复，而X-CGD小鼠肾损伤显著恶化（Kim-1 mRNA↑，p=0.0068）。此时X-CGD组肾脏内NETosis累积量较WT增加（p=0.0022），并伴随趋化因子风暴：CXCL2、CXCL3、CCL2、CCL3及其受体CXCR2、CCR1、CCR2 mRNA显著上调。同时，促炎因子IL-1β、TNFα、IL-6及NETosis关键酶PAD4转录水平明显升高，表明NOX2非依赖性NETosis在损伤后期驱动了持续的炎症级联反应。

X-CGD小鼠肾组织中氧化线粒体DNA（ox-mtDNA）标志物8-OHdG阳性信号显著增强（p=0.012），且与NETs区域共定位。体外实验进一步揭示：RNP免疫复合物（sn-RNP-Ag和RNP-IC）能特异性诱导X-CGD来源的中性粒细胞中sytox绿色荧光表达和释放大量ox-mtDNA，而TLR配体（LPS/R848）或PMA几乎无效。通过MitoSOX流式检测进一步证实，RNP刺激后ox-mtDNA介导的NETosis现象显著。

图1. TLR配体及RNP免疫复合物刺激骨髓来源的中性粒细胞后NETs形成的比较

在评估cGAS/STING通路对I/R诱导的AKI影响的实验中，预先给予X-CGD小鼠cGAS/STING通路抑制剂C-176可显著减轻I/R后24小时的AKI，抑制肾脏内NETosis的积累，降低ox-mtDNA水平，并减少Kim-1和PAD4的mRNA表达。这表明cGAS-STING轴是NOX2非依赖性NETosis介导肾损伤的核心枢纽，为靶向治疗提供了实验依据。

图2. cGAS/STING通路抑制剂C-176显著抑制肾脏内NETosis，减轻X-CGD小鼠I/R后急性肾损伤

研究结论

X-CGD小鼠体内NOX2非依赖性NETosis的过度激活，导致了大量富含ox-mtDNA的NETs在肾脏内异常积累。这些NETs通过激活cGAS/STING通路，显著增强了肾脏的炎症反应，进一步加剧了组织损伤。在体外实验中，X-CGD小鼠的骨髓中性粒细胞对RNP成分刺激表现出更高的NETosis敏感性，这表明NOX2非依赖性NETosis在特定病理条件下具有显著的活性。更关键的是，通过预先给予cGAS/STING通路抑制剂C-176，能够显著减轻X-CGD小鼠肾脏损伤，抑制NETosis的积累以及ox-mtDNA的表达。

CGD患者常伴有严重的炎症并发症，包括NOX2缺陷相关肾病。本研究提示，针对NOX2非依赖性NETosis的治疗策略（如STING抑制剂或ox-mtDNA清除剂）可能对这类患者有效。

此外，未来需探讨这种NETosis是否在其他NOX2缺陷疾病（如动脉粥样硬化或自身免疫病）中普遍存在。同时，结合类器官模型或患者来源样本，验证NETosis抑制剂（如DNase I或PAD4抑制剂）联合cGAS/STING阻断的协同疗效，以推动临床转化。

研究证明cGAS/STING抑制剂C-176显著减轻AKI，提示该通路是治疗炎症性肾病的潜在靶点。未来需优化抑制剂的选择性、给药时机和剂量，以平衡抗炎效果与免疫监视功能。此外，可结合单细胞测序技术，明确肾脏中特定细胞类型（如近端小管细胞或巨噬细胞）对cGAS/STING激活的响应差异，为精准治疗提供依据。