从意大利的PREDATOR研究里选取136例接受根治切除的mCRC患者纳入研究，首要研究终点是术后DFS率，次要终点包括总生存（OS）率及转化分析。患者及临床医生对ctDNA检测结果并不知情，统计人员对临床资料亦不知情。

为进行个体化的mPCR-NGS，先对石蜡包埋肿瘤组织及作为对照的正常血样本进行全外显子测序（WES），由16例患者获得的特异体细胞克隆单核苷酸变异（SNVs）panel被用来进行mPCR检测，血浆里检测到高于预先设定的可信阈值≥2个SNVs被认为是ctDNA阳性。ddPCR（Bio-Rad）检测7个KRAS突变位点，包括G12A (dHsaCP2500586)、G12C (dHsaCP2500584)、G12D (dHsaCP2500596)、G12R (dHsaCP2500590)、G12S (dHsaCP2500588)、G12V (dHsaCP2500592)和G13D (dHsaCP2500598)。

最终来自112例患者的192份血浆用于ctDNA检测，中位随访时间为10.7个月，其中，73.2%患者（82/112）出现了肿瘤进展。患者一共进行两次血浆ctDNA检测，第一次为根治切除术后辅助化疗前，第二次为第一次影像学出现进展或最后一次随访时（见Fig1）。

其中55例患者（49%）接受了术前化疗，44例患者（39%）接受了术后化疗。112例患者中，肝转移（65/112，58.0%）是最常见的转移部位。具体临床病理资料见Table 1。

 根治切除术后中位27天，在辅助治疗前，112例患者接受了血浆检测。其中62例患者（54.5%）为MRD阳性，51例（45.5%）为MRD阴性。初次检测的敏感性为72%，特异性为93.3%，阳性预测值为96.7%。

对于MRD阳性且出现疾病进展的患者，中位领先时间为3.16个月。MRD阳性患者的DFS率和OS率明显短于MRD阴性患者（p均＜0.001）。多因素分析也提示MRD阳性是影响患者DFS率最重要的预后因素。（见Fig 2 和Fig 3）

将有首次（基线）及末次ctDNA（复发时或最后一次随访）检测结果的80例患者进行分析，两次检测均为阳性或第二次检测阳性的患者定义为ctDNA阳性组（45例），而两次检测均为阴性或第二次检测为阴性的患者定义为ctDNA阴性组（35例）。

ctDNA阳性组的患者97.7%（44/45）出现肿瘤进展，对于50例术后未接受辅助化疗的患者进行分析发现，一共35例患者出现疾病进展，其中32例为ctDNA阳性，敏感性为91.4%，特异性为93.3%；而对于未接受术后辅助化疗组，ctDNA阳性者的DFS率和OS率也明显短于ctDNA阴性组，ctDNA阴性组在50个月的随访中OS率为100%。（见Fig 4）

对27例患者术后进行了ddPCR检测，同时这部分患者也接受了个体化mPCR-NGS检测，结果提示两者的一致性为55.5%，所有不一致的患者均为ctDNA阳性而ddPCR阴性者，其中91.6%（11/12）患者出现肿瘤进展，提示个体化mPCR-NGS对比ddPCR有更高的敏感性，可更好的预测肿瘤进展。对于55例术后既有ctDNA检测结果又有血CEA结果的患者进行分析发现，CEA并不能预测DFS率，而个体化定制的mPCR-NGS ctDNA检测可准确预测DFS率（p<0.001）。对于疾病最终进展的13例患者进行分析发现个体化定制的mPCR-NGS ctDNA检测的敏感性最高，为84.6%（11/13），而CEA和ddPCR 的敏感性分别只有46%和38.4%。（见Fig 5）

对于mCRC，R0切除术后血ctDNA水平与手术的根治性相关，提示ctDNA可以作为MRD的生物标志，帮助早期发现肿瘤进展，进一步合理的治疗方案。本研究通过tumor-informed mPCR-NGS法检测术后ctDNA，发现96.7%（59/61）的MRD阳性患者最终出现肿瘤进展，并且术后MRD阳性组患者的DFS率和OS率明显短于阴性组，因此对MRD阳性患者可进行更积极的辅助治疗和更严密的随访。

目前，对于血ctDNA的检测的路线，文献报道的方法很多种，无外乎两大路线，一是tumor-naïve的广撒网方法，通过增加UMI、polishing算法及测序深度来增加敏感性，但从文献报道的结果看这种方法对术后仅存MRD的患者检出的阳性率并不高，并且特异性很难保证；另一种路线是tumor-informed的方法，根据术前肿瘤测序（WES）提供的突变信息建立术后ctDNA检测的panel，这样可以在保证特异性的前提下最大限度地增加测序深度，从而增加敏感性。

本研究就是基于后者进行的个体化定制panel的mPCR-NGS，而ddPCR只能对RAS突变的几个位点进行检测。本研究针对只有KRAS突变的患者进行了个体化mPCR-NGS方法与ddPCR方法检测ctDNA的比较，发现前者的敏感性明显优于后者（84.6% 对 38.4%）。与血CEA相比，个体化mPCR-NGS检测ctDNA阳性患者预测疾病进展的敏感性明显优于血CEA升高。

第一，本研究为回顾性研究，病例数较少，因接受术前化疗，有16.9%的患者术前组织标本坏死率过高，导致WES质控不合格。

第二，本研究只测了术后2个时间点的ctDNA水平，对比连续检测还有很多的劣势，包括早期的治疗干预、随访强度及对治疗有效性的评估等。

第三，本研究还发现术后第一次MRD检测阴性的患者中28%出现疾病进展，而第二次检测MRD阴性的患者有8.6%的患者出现疾病进展。第一次检测的假阴性可以用术后4周内高cfDNA水平可能掩盖了ctDNA的阳性，因此，建议术后4周后再进行ctDNA检测，最好能动态检测。其他解释ctDNA假阴性的原因包括惰性肿瘤及不同的转移部位的影响。

北京大学肿瘤医院肝胆外一    平台发布