胰腺神经内分泌肿瘤(pancreatic neuroendocrine tumor，pNET)是一种相对罕见、起源于胰腺内分泌细胞和肽能神经元的肿瘤。近年来，pNET发病率呈上升趋势[1]。根治性手术切除是目前唯一可治愈pNET的治疗策略，然而pNET起病隐匿、早期诊断困难，很多患者至中晚期才能被确诊以致失去根治性手术指征[2]。对于转移性pNET患者，目前已有旨在控制症状和抑制肿瘤生长的治疗方式，但部分患者仍获益有限。肿瘤微环境被认为是决定肿瘤生物学的关键因素，近年来随着对肿瘤微环境研究的深入，为pNET致病机理和靶向治疗方面提供了新思路。

1.pNET的肿瘤微环境

pNET肿瘤微环境主要由肿瘤细胞、肿瘤相关中性粒细胞(tumor-associated neutrophils，TAN)、肿瘤相关巨噬细胞(tumor-associated macrophages，TAM)、肿瘤相关成纤维细胞(carcinoma-associated fibroblasts，CAF)、调节性T淋巴细胞(Treg)及骨髓来源抑制细胞(myeloid derived suppressor cells，MDSC)等细胞成分及细胞外基质(ECM)等相互作用共同构成。pNET肿瘤微环境主要表现为低免疫原性、高免疫抑制性特点，即虽然有不同的免疫/免疫抑制细胞浸润，但具有抗肿瘤作用的免疫效应细胞多处于数量与功能失衡状态，而免疫抑制细胞则功能活跃且大量存在并分泌抑制性细胞因子诱导局部/全身免疫抑制。此外，高度血管化以及活跃的ECM重塑也是pNET免疫抑制性肿瘤微环境的重要促成因素，为pNET血管新生、细胞增殖、侵袭转移及抗肿瘤治疗耐药创造了有利条件。

1.1   pNET肿瘤微环境中主要的抗肿瘤免疫成分

pNET肿瘤微环境中的免疫细胞(尤其是T淋巴细胞)是介导抗肿瘤免疫的主要细胞成分。研究[3]显示，pNET肿瘤微环境中存在不同的T淋巴细胞群，包括CD4+T淋巴细胞、CD8+T淋巴细胞、CD45RO+T淋巴细胞及CD3+T淋巴细胞，但抗肿瘤免疫反应受到不同程度的限制，使pNET细胞能够逃避免疫监控。pNET中丰富的TAM、MDSC等免疫抑制细胞可产生T淋巴细胞激活负调控因子如程序性死亡配体1(programmed death ligand-1，PD-L1)抑制效应T淋巴细胞的活化和功能[4-5]。此外，pNET细胞本身也可通过多种机制抑制免疫细胞的抗肿瘤作用：(1)表达程序性死亡受体1(programmed death 1，PD-1)以及细胞毒T淋巴细胞相关抗原4(cytotoxic T-lymphocyte antigen 4，CTLA-4)的相关配体以诱导效应T淋巴细胞凋亡、失活和耗竭[3, 6]；(2)抑制pNET中人类白细胞抗原Ⅰ的成分(如β2-微球蛋白)的表达，阻碍抗原呈递以抑制CD8+T淋巴细胞免疫应答[7]；(3)通过肿瘤细胞和CAF过表达的吲哚胺2, 3-双加氧酶和色氨酸2, 3-双加氧酶消耗肿瘤微环境中对T淋巴细胞增殖至关重要的色氨酸，生成犬尿氨酸及其衍生物，促进Treg生成及抑制树突状细胞的免疫原性[8]。

三级淋巴样结构(tertiary lymphoid structures，TLS)是在非淋巴组织中形成的免疫细胞的有组织聚集体，可招募免疫细胞流入肿瘤部位，推动免疫反应对抗肿瘤的发生和进展。Allen等[9]发现在RIP1-Tag2小鼠模型中，PD-L1阻断联合抗血管内皮生长因子受体(vascular endothelial growth factor，VEGFR)2抗体DC101可诱导高内皮小静脉形成并激活淋巴素β受体信号通路促进淋巴细胞浸润及TLS形成，从而抑制pNET肿瘤生长及转移。在Zhang等[10]的研究中超过1/3的非功能pNET存在TLS浸润，其中最大的TLS亚群是CD45RO+T淋巴细胞(39.35%)，其次是CD20+B淋巴细胞(36.61%)、CD4+T淋巴细胞(20.05%)、CD8+T淋巴细胞(3.99%)，而免疫抑制细胞(CD68+巨噬细胞和Treg)则浸润较低，与患者更好的临床预后如淋巴结阴性、无血管和神经侵犯、TNM分期及WHO分级较低有关，所以，诱导TLS形成有望成为未来pNET治疗新的研究方向。

1.2   免疫抑制细胞

1.2.1   TAN

肿瘤组织可产生趋化因子趋化中性粒细胞通过血管壁进入肿瘤组织形成TAN，分泌基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMP)9等诱导血管生成、降解ECM和促进肿瘤发生，还能减弱CD8+T淋巴细胞的抗肿瘤作用并募集TAM和Tregs浸润促进肿瘤进展[11]，与pNET分级增加、肝脏转移、淋巴结及周围神经浸润显著相关，是预后不良的危险因素[12]。与TAM类似，与原发性肿瘤相比TAN浸润在肝脏转移性病变中更常见并可能与活跃的补体通路有关[13]。除了浸润状态，中性粒细胞死亡过程中产生的细胞外陷阱也影响pNET患者的生存结局。细胞外陷阱是以核内或线粒体内DNA为骨架，负载弹性蛋白酶和水解酶等组成的网状结构，可阻止肿瘤细胞与CD8+T淋巴细胞和自然杀伤细胞的接触及调节肿瘤微环境中的CAF。在pNET中就细胞外陷阱促肿瘤相关机制的研究还尚少，但最近Xu等[11]发现中性粒细胞、巨噬细胞细胞外陷阱阳性是肿瘤预后不良的独立危险因素，与无复发生存率降低相关。

1.2.2   TAM

TAM可分为M1型巨噬细胞(经典激活)和M2型巨噬细胞(替代激活)。肿瘤组织中浸润的TAM大部分通过肿瘤细胞和基质细胞产生的细胞因子和趋化因子从外周血募集并完成M2极化，从而分泌多种促血管生成因子和侵袭性介质调节肿瘤微环境。在pNET中，原发及转移性病灶均存在数量丰富的TAM，抑制了CD8+T淋巴细胞的浸润及肿瘤杀伤功能并分泌VEGF及血管生成素受体Tie-2，介导肿瘤血管生成转换及肿瘤生长、转移，是不良预后的标志[4, 6, 14]。此外，pNET细胞及TAM均可产生组织蛋白酶Z，并通过RGD(Arg-Gly-Asp)模体、整合素的参与及随后在肿瘤细胞中激活FAK-Src信号介导pNET细胞的侵袭及迁移[15]。

1.2.3   CAF

肿瘤细胞和CAF之间复杂的相互作用是病理性ECM重塑和结缔组织增生的主要原因，被认为是某些肿瘤的不良预后因素及治疗的重要靶点。在pNET中，肿瘤细胞可分泌TGF-β等可溶性因子刺激成纤维细胞的增殖和激活[16]，而CAF又可通过分泌TGF-β1、结缔组织生长因子和成纤维生长因子(fibroblast growth factor，FGF)限制T淋巴细胞浸润及募集、促进基质纤维化和血管新生[17-18]，或通过激活致瘤mTOR信号参与促进pNET的增殖、迁移及侵袭[19]。

1.2.4   Treg

Treg是一类具有显著免疫抑制作用的CD4+T淋巴细胞亚群，在生理条件下的免疫耐受维持中起着重要的作用，但也可通过分泌TGF-β、IL-10及CTLA-4、PD-1与T淋巴细胞受体结合，抑制CD4+辅助性T淋巴细胞1、CD8+T淋巴细胞以及自然杀伤细胞的增殖及活化从而驱动肿瘤细胞免疫逃逸。正常胰腺组织中Treg含量极少，但NET的发展伴随着激活的Treg逐渐积累，如研究显示高达97%的肝转移胃肠胰NET(GEP-NET)被Treg浸润，并在表面高表达PD-1、PD-L1[20-21]，Treg也是pNET患者疾病进展及肝转移的独立预后因素，浸润密度增加与总生存期的缩短显著相关[20, 22]。

1.2.5   MDSC

MDSC是由未成熟髓样细胞组成的异质性群体，包括单核型(M-MDSC)、粒细胞型(G-MDSC)和多核型(PMN-MDSC)亚群。在GEP-NET中，较高的循环和组织浸润M-MDSC可通过过表达PD-L1干扰抗肿瘤T淋巴细胞效应，促使肿瘤免疫逃逸，与肿瘤的分期增加和转移显著相关，具有鉴别转移亚组甚至对潜在的早期转移作出预测的作用[5]。

1.2.6   肥大细胞

肿瘤组织中的肥大细胞活化后能分泌多种介质参与肿瘤微环境的重塑及诱导血管新生[23]。Soucek等[24]研究表明胰岛β细胞内转录因子Myc的激活通过释放IL-1β等介质招募肥大细胞、巨噬细胞及中性粒细胞快速涌入肿瘤及其邻近间质，从而构建有利于胰岛素瘤血管生成及生长的微环境，而抑制肥大细胞脱颗粒或创建肥大细胞缺陷小鼠模型可诱导肿瘤和内皮细胞缺氧和凋亡，使肿瘤增殖受抑。然而一项对187例pNET患者常见免疫细胞的综合分析研究[25]显示，肥大细胞在pNET中有潜在抗肿瘤作用，是无进展生存期(progression free survival，PFS)延长的独立预测因子。因此，肥大细胞浸润与预后的好坏相关，其在pNET中的作用机制及效应还需要进一步研究。

1.3   pNET微环境中的细胞外成分

1.3.1   ECM及ECM降解

肿瘤相关ECM可阻止药物扩散并促进肿瘤细胞的增殖、迁移和血管生成。Naba等[26]用定量蛋白质组学方法证实RIP1-Tag2小鼠胰岛素瘤模型ECM蛋白表达组成明显改变，纤维蛋白-3、纤维蛋白原和激肽原显著上调，而饰胶蛋白、半椎蛋白、凝集素、半乳糖凝集素-1等则表达下调，促进了胰岛素瘤血管生成转换和微血管生成。上皮间质转化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)是肿瘤细胞由上皮细胞向间充质细胞转化的过程，是肿瘤细胞实现转移前获得侵袭性表型的关键步骤。在TGF-β等EMT诱导信号作用下[19]，Twist等转录因子表达升高可诱导细胞黏附分子E-cadherin下调，促使上皮细胞失去极性和细胞间黏附作用，转化为间充质表型，从而促进胶原合成及启动pNET浸润和转移[27]。

ECM的降解及重塑也是肿瘤浸润性生长及转移的重要促成部分。在肿瘤微环境中，被降解的ECM成分碎片可招募炎症细胞浸润创造有利于肿瘤生长的局部微环境，而重塑后的ECM可促进肿瘤细胞穿越宿主组织屏障并诱导生长因子释放和促进肿瘤血管新生。pNET中ECM的动态变化主要归因于肝素酶和MMP家族。肝素酶是一种内源性β-葡萄糖醛酸酯酶，主要来源于肿瘤微环境中的Gr1+/Mac1+先天免疫细胞(如巨噬细胞)，在RIP1-Tag2小鼠胰岛素瘤的多阶段进展过程中不断增加，可裂解ECM糖蛋白的肝素硫酸盐侧链导致基质松动，并动员VEGF等促血管生成分子诱导血管、肿瘤周围淋巴管生成，促进肿瘤进展及远处转移[28-29]。MMP属于锌依赖性蛋白酶家族，在IL-1β等的作用下，MMP9于肿瘤微环境中积累可降解ECM并促进pNET细胞增殖和迁移[30]，但抑制pNET中MMP9表达可改变肿瘤微环境中蛋白酶谱，使半胱氨酸组织蛋白酶尤其组织蛋白酶B表达上升，从而参与降解纤连蛋白、Ⅰ/Ⅳ型胶原蛋白、层粘连蛋白等ECM成分以及E-钙黏蛋白，加速肿瘤进展[31]。

1.3.2   血管生成

pNET是一种高度血管化的肿瘤，其血管生成由以下多种途径介导：(1)促血管生成因子产生增多。在pNET中肿瘤细胞及基质细胞可分泌血小板源性生长因子、信号素、神经纤毛蛋白2及Tie-2、c-kit、VEGF等促血管生成因子参与促进pNET血管生成[6, 14, 32-33]。(2)ECM中基质蛋白诱导。骨膜蛋白可促进人pNET中M2-TAM的募集及极化并使FGF表达升高，直接促进血管内皮细胞增殖、血管成熟及调节肿瘤细胞和基质细胞产生其他促血管生成分子，诱导pNET血运重建[34-35]。(3)乏氧微环境诱导。在快速增殖的pNET小鼠肿瘤缺氧区域缺氧诱导因子-1α(hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α)控制酶CYP46A1过表达，可通过激活HIF-1α-24S-HC轴使促血管生成中性粒细胞在CYP46A1+胰岛附近定位，诱导血管生成转换及肿瘤增长[36]。

2.pNET微环境的靶向及免疫治疗进展

2.1   靶向肿瘤血管生成

抗血管生成药物主要包括酪氨酸激酶抑制剂(tyrosine kinases inhibitor，TKI)和非酪氨酸激酶抑制剂。继舒尼替尼之后，包括帕唑替尼、卡博替尼等在内的多靶点TKI已被证实在pNET中可获得良好疗效，其在pNET治疗中的应用及研究进展主要体现在一些新药的研究成果。索凡替尼是国产小分子多靶点TKI，SANET-p Ⅲ期研究[37]显示，索凡替尼治疗延长了晚期pNET患者的中位PFS(10.9个月) 且具有可接受的安全性，有望成为pNET晚期患者的一种治疗选择。仑伐替尼主要作用于VEGFR 1~3、成纤维生长因子受体(FGFR)1~4及kit。Ⅱ期TALENT临床研究[38]中仑伐替尼治疗pNET患者的客观缓解率(objective response rate，ORR)为44.2%，可显著延长中位PFS(15.7个月)，但疲劳、高血压和腹泻等不良反应较严重，高达93.7%的患者需要减少或中断剂量。除了一系列TKI药物，传统的非TKI药物还包括VEGF人源化单抗贝伐珠单抗。最近发表的一项Ⅱ期研究(CALGB 80701)[39]显示，依维莫司联合贝伐珠单抗治疗晚期pNET患者有较高的ORR(31%)且显著延长了PFS(16.7个月)，但治疗相关毒性反应也更为常见。

2.2   缺氧激活前药

抗血管生成治疗的主要缺点是在缺氧条件可诱导其他替代性促血管生成因子的产生并激活逃逸机制从而介导治疗耐药。缺氧激活前药与抗血管生成治疗联合使用可能通过在肿瘤缺氧区域内局部发挥细胞毒性作用而克服这一限制。如Evofosfamide(TH-302)可在缺氧的肿瘤区域选择性激活并进一步转化为细胞毒性效应剂：DNA烷化剂溴代异磷酰胺氮芥从而杀死肿瘤细胞。在pNET中，SUNEVO Ⅱ期研究[40]显示舒尼替尼联合TH-302治疗可使17.6%的患者达到完全或部分缓解，PFS为10.4个月，但全身毒性较高致使88.2%的患者停止治疗而不具可行性，提示未来研究中应尝试用其他更安全的疗法克服pNET对抗血管生成药物的耐药性。

2.3   抗免疫抑制性细胞治疗

肿瘤微环境中异常的免疫抑制细胞组分为pNET的治疗提供了靶点。Tie-2+巨噬细胞是促血管生成和组织重塑功能极强的TAM亚群，能促进血管淋巴管生长、抑制抗肿瘤免疫从而驱动肿瘤发生发展及治疗耐药。有研究[14]显示Rebastinib治疗减少了Tie-2+巨噬细胞募集、浸润和血管生成素的生成，显著抑制了pNET小鼠模型肿瘤的生长和转移。氯膦酸盐脂质体是一种巨噬细胞清除剂，可通过巨噬细胞内吞作用进入TAM并诱导其凋亡。在RIP1-Tag2小鼠胰岛素瘤模型中，氯膦酸盐脂质体可显著消耗巨噬细胞，增强抗肿瘤CD3+T淋巴细胞浸润比例，导致肿瘤血管生成受抑并抑制了肿瘤侵袭性生长和恶性转化[4]。伊布替尼是一种布鲁顿TKI，可抑制肥大细胞脱颗粒使pNET动物模型血管塌陷和肿瘤消退，然而2019年最新公布的一项验证伊布替尼抗GEP-NET作用的Ⅱ期临床试验中并没有达到客观治疗反应[41]。因此，靶向肿瘤微环境的免疫抑制细胞，恢复抗肿瘤免疫细胞活性及功能是一种极具潜力的pNET治疗方法，进一步研究有望为pNET患者带来新的突破。

2.4   免疫检查点抑制剂

免疫检查点抑制剂(immune checkpoint inhibitors，ICI)是通过靶向阻断肿瘤细胞及基质细胞上过表达的免疫检查点分子，逆转免疫抑制信号进而增强抗肿瘤免疫反应的治疗手段。ICI的出现改进了肿瘤治疗方案。然而，有研究[42-43]表明在pNET中ICI单药如派姆单抗和斯巴达pNETPD-1抑制剂)治疗pNET的ORR分别为6.3%、3.0%，均未达到有效的客观缓解(≥10%)。分析其疗效可能受限于pNET中PD-L1表达较少、肿瘤突变负荷低、微卫星不稳定及DNA错配修复缺陷少见、对T淋巴细胞杀伤内在不敏感等特性。根据pNET肿瘤微环境的特点及其对免疫治疗的影响，将不同的纠正免疫抑制肿瘤微环境的策略联合应用可能有助于改善pNET的治疗效果。如CA209-538研究[44]显示伊匹木单抗(CTLA-4抑制剂)和纳武利尤单抗(PD-1抑制剂)联合治疗在高级别pNET患者中ORR高达43%，改善了pNET患者PFS和总生存期。此外，可放大抗肿瘤应答的溶瘤病毒是正在评估的可增加对免疫检查点阻断易感性的治疗方式之一。研究[45]显示mpJX-594联合PD-1单抗可协同诱导CD8+T淋巴细胞及自然杀伤细胞内流促进抗肿瘤免疫，显著抑制肿瘤增殖及肝转移，延长了pNET小鼠模型的生存时间。

2.5   嵌合抗原受体T淋巴细胞免疫疗法

嵌合抗原受体T淋巴细胞(chimeric antigen receptor-modified T-cell，CAR-T)是利用基因编辑技术将改装的T淋巴细胞回输到患者体内从而精准靶向杀伤肿瘤细胞的一种新型细胞免疫疗法，可为肿瘤患者提供持久有效的抗肿瘤免疫能力。生长抑素受体(somatostatin receptor，SSTR)在GEP-NET中广泛表达且与肿瘤分化程度和预后相关[46]，因此靶向SSTR的CAR-T淋巴细胞为SSTR+GEP-NET提供了新的免疫干预措施，且在体内外研究中都显示出了高度特异性的抗肿瘤活性[47]。CDH17又名LI钙黏蛋白，是重链单域抗体(variable domain of heavy chain of heavy-chainantibody)的靶点，既可在NET肿瘤细胞表达，也表达于健康组织如肠上皮细胞之间侧膜。最近Feng等[48]研发了靶向CDH17的纳米抗体VHH1驱动CAR-T(CDH17CAR-T)，通过体外研究发现，CDH17CAR-T能特异性杀伤人和小鼠pNET肿瘤细胞，且进一步在异种移植瘤或原发小鼠模型中避免攻击同样表达CDH17正常细胞的同时根除表达CDH17的pNET细胞。因此，CAR-T疗法在pNET治疗中有巨大潜力，对CAR-T及相关靶点进一步研究有希望为pNET治疗开展新篇章。

3.小结

在pNET中，免疫抑制肿瘤微环境的形成不仅为肿瘤的发生发展及远处转移创造了有利条件，也为pNET的治疗带来了难度。因此阐明肿瘤微环境中更全面、完整的免疫浸润的促/抗肿瘤机制、识别潜在治疗靶点可为进一步了解pNET的发生发展机制及合理设计成功的临床试验改善患者预后奠定基础。目前，针对pNET微环境的ICI、CAR-T免疫疗法等已成为pNET治疗的研究热点并在临床前研究中取得了新的进展，有待进一步的临床验证。总之，根据肿瘤微环境的特点设计合理的治疗策略，清除TAN、TAM等过多的免疫抑制细胞、增加效应T淋巴细胞的浸润及其抗肿瘤活性以逆转免疫抑制性肿瘤微环境，有望为更高效、精确的治疗pNET带来新的突破。