长期酗酒可造成多器官损伤，其中对于肝脏、心脏和神经系统研究较多，对肾损伤的研究相对较少。长期重度饮酒会加速慢性肾脏病进展，引起肾功能异常及结构损害[1]。乙醇通过线粒体功能障碍、氧化应激和炎症直接损伤肾脏[2-4]，也可通过肠道通透性改变、肝脏损伤、微循环障碍及心脏功能障碍间接促进肾损伤[5-6]。目前针对酒精相关肾损伤缺乏特异性干预措施。六维磷脂软胶囊（HexaV）是以大豆磷脂和B族维生素为主的复方制剂。大豆磷脂主要由甘油、脂肪酸和磷酸酯构成，可调节动物脂类代谢[7]。在酒精性肝损伤模型中，大豆磷脂能增强抗氧化能力并抑制肿瘤坏死因子α（TNF-α）等炎症因子[8]。但其在酒精相关肾损伤的作用尚缺乏研究。

本研究建立酒精相关肾损伤小鼠模型，并予以HexaV干预，通过转录组测序筛选差异基因及富集通路，并结合实时荧光定量PCR（qPCR）验证。重点关注肾素-血管紧张素系统（RAS）和白细胞介素（IL）-17信号通路在酒精相关肾损伤中的作用及HexaV的逆转效应。

动物模型　6周龄无特定病原体（SPF）级C57BL/6N小鼠（购自北京维通达生物技术有限公司）随机分为三组，每组10只。参考已报道的建立酒精肝病模型的方法[9]，酒精相关肾损伤模型（ETOH）组给予32.5%乙醇灌胃，按照5 g/（kg·d）的量，1次/d×8周。正常对照（NC）组予以等量蒸馏水。ETOH+HexaV组同时予以32.5%乙醇和HexaV灌胃处理。HexaV按照等效剂量换算[10]，以0.8 mg/g体重灌胃，1次/d×8周（图1A）。本动物实验方案经首都医科大学实验动物伦理委员会批准（伦理批号：AP2023046）。

图1　A：模型小鼠构建流程图；B：三组小鼠SCr水平；C：肾组织HE、Masson、PAS染色（×400）

SCr：血清肌酐；NC：正常对照组；ETOH：酒精相关肾损伤模型组；ETOH+HexaV：六维磷脂处理组

血清肌酐（SCr）测定　收集小鼠眼球血，以4 ℃，3000 rpm离心10 min。吸取上层血清检测SCr。

肾组织病理染色　肾组织经4%多聚甲醛固定、石蜡包埋、切片后，依次进行脱蜡水化，分别进行HE染色、Masson染色和PAS染色。取小鼠肾组织石蜡切片经脱蜡水化、抗原修复及封闭后，滴加血管紧张素转换酶2（ACE2）抗体（1∶200，GB15267，Servicebio）4 ℃过夜孵育，二抗孵育、DAB显色、苏木素复染，脱水封片后于显微镜下观察拍照。

转录组分析　取各组小鼠肾组织（n=5），由上海欧易生物技术有限公司进行转录组测序。提取mRNA并质检合格后建库，Illumina NovaSeq 6000测序和分析。数据质控后用分层剪接比对索引工具2（HISAT2）比对，高通量测序计数工具（HTSeq-count）定量。主成分分析（PCA）基于R软件prcomp函数，差异表达测序分析工具2（DESeq2）标准化并过滤低表达基因后纳入分析（n=24 347）。差异表达分析、京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路富集分析及基因集富集分析（GSEA）均在上海欧易生物在线分析平台完成。差异基因筛选标准为对数2倍变化绝对值（|log₂FoldChange|）≥1.0，校正后P<0.05。KEGG分析以校正后P<0.05为显著。GSEA分析以错误发现率（FDR）<0.25且P<0.05为显著。

qPCR　取20 mg肾组织冰上提取RNA并逆转录，以GAPDH为内参，采用2-ΔΔCt法计算相对表达量。引物由上海捷瑞生物合成（表1）。

表1　实时定量PCR引物序列

统计学方法　采用GraphPad Prism 9.5软件进行描述性分析和统计作图，连续变量先进行正态性及方差齐性检验。正态分布的数据以均数±标准差表示，两组间比较用t检验或Mann-Whitney U检验。P<0.05为差异有统计学意义。

HexaV可改善长期酗酒所造成肾脏病理变化　与NC组相比，ETOH组SCr水平显著升高，而ETOH+HexaV组SCr水平显著低于ETOH组（图1B）。ETOH组肾脏HE染色可见肾小球萎缩，系膜增殖，间质炎性细胞浸润，肾小管上皮细胞空泡性变性。Masson染色可见更明显的蓝色胶原沉积，PAS染色可见紫红色线条增宽。在ETOH+HexaV组上述病理表现均得到改善（图1C）。表明HexaV可改善酒精所致肾脏损害。

HexaV对肾脏组织基因表达的调控作用　为进一步探讨HexaV改善酒精性肾损伤，每组选取5只小鼠全肾组织进行转录组测序。PCA显示三组分群有显著差异（图2A）。与NC组相比，ETOH组中，以|log₂FoldChange|≥1.0且校正后P<0.05筛选出115个基因，其中上调基因72个，下调基因43个（图2B、D）。与ETOH组相比，在ETOH+HexaV组共筛选到334个基因，上调基因219个，下调基因115个（图2C、D）。

图2　A：三组的PCA结果；B：NC组vsETOH组差异基因火山图；C：ETOH组和ETOH+HexaV组差异基因火山图；D：NC组vsETOH组的差异基因与ETOH vs ETOH+HexaV的差异基因韦恩图；E：27个共有差异基因热图

NC：正常对照组；ETOH：酒精相关肾损伤模型组；ETOH+HexaV：六维磷脂处理组；PCA：主成分分析；log₂FoldChange：对数2倍变化；padj：校正后P值；ALD：酒精性肝病

ETOH组和ETOH+HexaV组中存在27个相同差异基因（表2），其中22个在ETOH组上调，在ETOH+HexaV组下调，包括Ren1、Slc16a1、Plin4、H2-Q10、Lrg1、Mtarc1、C3、Fga、Fam167a、Cyp2b10、Fgg、Klk1b24、Klk1b9、Slc38a3、Klk1b27、Ffar4、Lcn2、Bmal1、Lypd3、Saa1、Cyp27b1、Klk1b16。Ces1g、Rph3a、Dnah9和Dbp在ETOH组下降，在ETOH+HexaV组上调，Creb3l3在两组均下降（图2E）。

表2　各组27个差异基因的表达及显著性指标

NC：正常对照组；ETOH：酒精相关肾损伤模型组；ETOH+HexaV：六维磷脂处理组；log₂FoldChange：对数2倍变化；GFR：肾小球滤过率；RAS：肾素-血管紧张素系统；TGF-β：转化生长因子β

HexaV改善肾脏损伤相关通路　KEGG富集显示，差异基因显著富集于RAS、过氧化物酶体增殖物激活受体（PPAR）信号通路、补体和凝血级联、昼夜节律、内分泌和其他因子调节的钙重吸收、近端肾小管碳酸氢盐回收、花生四烯酸代谢、脂肪酸延伸、不饱和脂肪酸生物合成、IL-17信号通路等（图3A）。结合以上数据，HexaV可能通过改善酒精相关肾损伤小鼠的肾脏血管活性通路、脂质代谢及炎症信号网络，发挥多靶点协同保护作用。

图3　A：27个差异基因KEGG富集分析；B、D、F：RAS通路、IL-17信号通路及内分泌和其他因子调节的钙重吸收通路在ETOH组vsNC组（左）和ETOH+HexaV vs ETOH组（右）GSEA分析；C、E、G为对应通路富集基因表达量

NC：正常对照组；ETOH：酒精相关肾损伤模型组；ETOH+HexaV：六维磷脂处理组；KEGG：京都基因与基因组百科全书；IL-17：白细胞介素17；RAS：肾素-血管紧张素系统；GSEA：基因集富集分析

进一步对差异基因进行GSEA富集分析发现，RAS、IL-17信号通路和内分泌及其他因子调节的钙重吸收均在ETOH组被激活，但在ETOH+HexaV组被逆转（图3B～G）。

HexaV应用改善了RAS及IL-17信号通路　ACE2免疫组化结果显示，与NC组相比，ETOH组小鼠ACE2表达量升高，而ETOH+HexaV组降低。同时，ETOH组中RAS通路中Agt、Ace2、Ren1和Klk1b3 mRNA水平上调，IL-17信号通路中IL17d、Mmp3、Mapk10、Jun、Rela、Cebpd、Mapk4、Cxcl2、Cxcl10、Lcn2和Fosb上调。提示酒精激活RAS并诱发代偿性ACE2上调及IL-17介导的炎症。而在ETOH+HexaV组上述指标显著降低（图4），表明HexaV通过抑制RAS驱动的血流动力学紊乱和IL-17介导的炎症反应发挥保护作用。

图4　A：三组ACE2免疫组化染色（×400）；B：三组肾脏中RAS及IL-17信号通路中Agt、Ace2、Ren1、Klk1b3、IL17d、Mmp3、Mapk10、Jun、Rela、Cebpd、Mapk4、Cxcl2、Cxcl10、Lcn2和Fosb mRNA表达水平

NC：正常对照组；ETOH：酒精相关肾损伤模型组；ETOH+HexaV：六维磷脂处理组；IL-17：白细胞介素17；RAS：肾素-血管紧张素系统；ACE2：血管紧张素转换酶2；数据以均数±标准差表示；采用单因素方差分析和Tukey多重比较检验；所有统计检验均为双侧检验；*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001

酒精可导致肾功能迅速且可逆地下降，引起SCr、尿素氮等含氮废物蓄积，进一步导致水电解质及酸碱平衡紊乱[11]。酒精所引起的肾脏损伤涉及氧化应激、炎症及线粒体功能障碍等多种机制[12-13]，同时多器官间相互作用也会加重肾脏损伤，因此明确其具体分子机制并探索治疗方案是必要的。

肾脏作为高度血管化且对血流变化敏感的器官，易受肾内血流及血管活性信号紊乱的影响。ETOH组Agt、Ren1、Ace2及Klk1b3等RAS相关基因显著上调。尽管筛选出的差异基因不包括Agt及Ace2，但作为RAS通路的关键基因，qPCR及免疫组化结果显示其表达水平存在显著变化。Agt和Ren1表达升高提示局部血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）生成增强。AngⅡ不仅促进血管收缩和肾小球高压[14]，还可诱导氧化应激、激活核因子κB（NF-κB）信号并刺激促纤维化介质表达[15-16]，与ETOH组观察到的病理变化一致。ACE2可将AngⅡ转化为Ang（1～7），减少AngⅡ累积[17]。其上调可能是代偿性保护反应，但不足以阻止肾损伤的进展。上述结果支持肾内RAS激活在酒精相关肾损伤中的核心作用。HexaV干预后RAS相关基因下调，提示其有助于改善肾内血流动力学紊乱。

炎症反应也是酒精诱导器官损伤的重要因素。IL-17通路通过Th17细胞介导炎症促进肾纤维化[18-19]。该通路激活后，ETOH组中IL17d、Cebpd、Cxcl2、Lcn2等基因表达上调。其中C-X-C趋化因子配体2（CXCL2）在急性肾损伤中显著升高[20]。Lcn2与慢性肾病炎症与不良预后密切相关[21]。结果提示IL-17信号通路是酒精相关肾损伤的炎症放大调控轴。HexaV干预后该通路相关基因下调，说明其可抑制IL-17驱动的炎症反应。既往研究表明，AngⅡ可通过激活NF-κB及丝裂原活化蛋白激酶等通路，促进Th17细胞分化及IL-17表达[22]。提示RAS与IL-17通路之间可能存在正反馈交互作用，但需特异性阻断实验进一步验证。

此外，酒精相关肾损伤与肝损伤密切相关。本课题组既往研究已证实HexaV可以改善酒精性肝病[23-24]，但是本研究未开展特异性通路阻断的因果验证实验，不能排除其肾保护作用来源于系统性改善效应。

本研究存在以下局限性。首先，本研究基于小鼠慢性酒精暴露模型，需要临床样本或前瞻性研究进一步验证；其次，RAS和IL-17信号通路交互机制仍需进一步探索；此外，HexaV为复合制剂，各组分的相对贡献尚未明确，未来可通过单一组分干预或药理分离策略明确关键活性成分。另外，HexaV是否能够在肾脏组织中富集仍缺乏直接证据，可通过药代动力学或示踪实验验证。

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